7.3.2.14스피노사드(Spinosad)

가. 시험법 적용범위가금류고기, 알 등 축산물에 적용한다.

나. 분석원리시료를 아세토니트릴로 추출하고, 황산마그네슘, 아세트산나트륨을 이용하여정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

1) 액체
크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 특급

2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액 : 스피노신 A 및 스피노신 D 표준품을 각각 아세토니트릴에 녹여 100 mg/L가 되게 하여 갈색병에 보관한다.

4) 표준용액 : 표준원액을 무처리 시료 추출물을 이용하여 적당한 농도로 혼합, 희석한다.

5) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

마. 시험용액의 조제

1) 추출
균질화한 닭고기에서 추출한 지방 1 g(알은 10 g)을 정밀히 달아 50 mL 원심분리관에 넣고지방(닭고기)은 증류수 5 mL와 1% 아세트산 함유 아세토니트릴 10 mL, 알은 아세토니트릴 10 mL를 가한 뒤 1분간 흔들어 섞은 후, 황산마그네슘 6 g과 아세트산나트륨 1.5 g을 차례로 넣어1분간강하게 흔들어 섞는다 .혼합후 추출물을 1,700G로 5분간 원심분리 한다. 상층액 1.5 mL를 2.0 mL 원심분리관에 옮긴 후 불순물 제거를 위한 다중벽 탄소나노튜브(multi-wall carbon nano tubes, 직경 20∼40 nm, 길이 5∼15 ㎛) 6 mg과 황산마그네슘 225 mg을 넣고 10초간 흔들어 섞은 후 1,400G로 5분간 원심분리한다. 정제된 상층액 1 mL를 멤브레인 필터(PTFE, 0.2 μm)로 여과한 후 갈색 바이알에 옮겨 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼 : C18(3.0 mm × 150 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 컬럼 온도 : 30℃

다) 이동상

(1) 이동상 A : 아세토니트릴

(2) 이동상 B : 0.1% 포름산 함유 물

(3) 농도구배조건

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	10	90
4.0	100	0
5.0	100	0
7.0	10	90
10.0	10	90

라) 이동상 유속 : 0.3 mL/분

마) 주입량 : 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법 : ESI positive-ion mode

나) Capillary Voltage : 3.5 kV

다) Collision gas : 아르곤(Ar)

라) Cone voltage : 42 V

마) 액체크로마토그래프-질량분석기 분석을 위한 특성이온

분석성분 (Compound)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion,m/z)	생성이온(Product ion,m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
스피노신 A (Spinosyn A)	731.9	731.4	732	1421)	46
				98	60
스피노신 D (Spinosyn D)	745.9	745.4	746	1421)	42
				189	50

1)정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프-질량분석기에서 표준품의 크로마토그램 예시.

스피노신 A(A : 4.95분), 스피노신 D(B : 5.01분)

5) 정량한계
가) 0.001 mg/kg(알) 나) 0.01 mg/kg(가금류고기(지방))

사. 정량시험위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 각각의 검량선에 대입하여 스피노신 A와 스피노신 D의 합으로써 스피노사드 함량을 정량한다.

아. 확인시험액체크로마토그래프-질량분석기상의 머무름 시간과 특성이온으로 스피노신 A와 스피노신 D를 확인한다.