3.2.2 아세설팜칼륨(acesulfame K), 사카린나트륨 및 아스파탐 동시분석법

가. 분석원리

식품 중의 아세설팜칼륨(acesulfame K),사카린나트륨 및 아스파탐을 물로 추출 후 여과하거나 여과액을 아세설팜칼륨(acesulfame K)과 사카린나트륨은역상계 및 강음이온교환형 카트리지, 아스파탐은 강양이온교환형 카트리지로 각각 정제한 다음 액체크로마토그래프로 정성 및 정량분석하는 방법이다.

나. 장치

1) 정제용 카트리지

가) 역상계 카트리지：Sep-pak C18또는 이와 동등한 것(사용전에 메탄올 5 mL 및 물 5 mL를 차례로 흘려 보낸 후 사용한다).

나) 강음이온교환형 카트리지：Sep-pak QMA 또는 이와 동등한 것(사용전에 메탄올 5 mL 및 물 5 mL를 차례로 흘려 보낸 후 사용한다).

다) 강양이온교환형 카트리지：Bond Elut SCX 또는 이와 동등한 것(사용전에 메탄올 5 mL 및 물 5 mL를 차례로 흘려 보낸 후 사용한다).

다. 시약 및 시액

1) 혼합표준용액：사카린나트륨을 120℃에서 4시간 건조시킨 후, 아세설팜칼륨(acesulfame K) 및 아스파탐은 그대로, 각각 100 mg을 정밀히 달아 물에 녹여 100 mL로 한다. 사용시 이 용액 1～10 mL를 취하고 물을 가하여 100 mL로 한 것을 표준용액으로 한다.

2) 카레스(Carrez)침전제 : 제1액 15% 페로시안화칼륨용액, 제2액 30% 황산아연용액

라. 시험용액의 조제

1) 액상검체

검체 약 5 g을 취하고 물을 가해 50 mL로 하여 0.45 μm 막 여과지(membrane filter)로 여과한 액을 시험용액으로 한다. 다만, 탄산가스가 있는 경우에는 10분간 초음파 처리하여 탄산가스를 제거하며 알코올을 함유한 경우는 70℃의 수욕상에서 15분간 가온하여 알코올을 증발시켜 검체를 취한다.

2) 고체 또는 반고체검체

검체를 미리 균질화하거나 잘게 썰어 잘 섞은 후 약 2～5 g을 취하여 물 10～20 mL를 가한 다음 10～20분간 흔들어 완전히 용해시키거나 10분간 초음파 추출한다. 이 액에 물을 가해 50 mL로 하고 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취한 다음 0.45 μm 막 여과지(membrane filter)로 여과한 액을 시험용액으로 한다.

3) 단백질 함량이 많은 검체

검체를 미리 균질화하거나 잘게 썰어 잘 섞은 후 약 2～5 g을 취하여 물 10～20 mL를 가한다. 이 액에 카레스(Carrez) 침전제 제1액 2 mL를 가해 흔들어 섞은 다음 다시 카레스(Carrez) 침전제 제2액 2 mL를 가해 2분간 흔들어 섞는다. 발생한 거품은 초음파 처리하여 제거한 후 물을 가해 50 mL로 하고 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취한 다음 0.45 μm 막 여과지(membrane filter)로 여과한 액을 시험용액으로 한다.

4) 지방 함량이 많은 검체

검체를 미리 균질화하거나 잘게 썰어 잘 섞은 후 약 2～5 g을 취하여 물 10～20 mL를 가한 다음 10～20분간 흔들어 완전히 용해시키거나 10분간 초음파 추출한다. 이 액에 물을 가해 50 mL로 하고 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취한 후 분액깔때기에 옮겨 디에틸에테르 50 mL를 가한 다음 흔들어 정치하고 물층을 취한다. 이 조작을 2회 반복하여 지방성분을 제거한 다음 0.45 μm 막 여과지(membrane filter)로 여과한 액을 시험용액으로 한다.다만, 상기 1)～4)의 조작후에도 정제가 필요한 경우는 5) 정제에 따라 시험한다.

5) 정제

가) 아세설팜칼륨(acesulfame K) 및 사카린나트륨

여과한 액 5 mL를 역상계 카트리지에 분당 3～4 mL의 속도로 떨어뜨리고 물 10 mL로 세척한 후 메탄올：물 (40：60) 혼합액 10 mL로 용출시킨다. 용출액 전량을 강음이온교환형 카트리지에 분당 3～4 mL의 속도로 떨어뜨리고 0.5% 인산 5 mL와 물 5 mL를 사용하여 세척한 후 0.3N 염산 약 5 mL로 분당 3～4 mL의 속도로 용출시켜 전량을 5 mL로 한 액을 시험용액으로 한다.

나) 아스파탐

여과한 액 5 mL를 강양이온교환형 카트리지에 분당 3～4 mL의 속도로 떨어뜨리고 물 10 mL를 사용하여 세척한 후 15% 염화나트륨용액 : 메탄올(50:50) 혼합액 5 mL로 분당 3～4 mL의 속도로 용출시켜 전량을 5 mL로 한 액을 시험용액으로 한다.

마. 시험방법

1) 액체크로마토그래프의 측정조건

가) 검출기 : 자외선흡광검출기(UV photometric detector), 210 nm

나) 칼럼：Nova-Pak C18또는 이와 동등한 것

다) 칼럼온도 : 25～40℃의 일정온도

라) 이동상：10% TPA-OH(Tetrapropyl ammonium hydroxide) 20.3 mL를 메탄올：물(20：80)의 혼합액 약 900 mL에 녹이고 인산으로 pH를 4.0으로 조정한 다음 메탄올：물(20：80) 혼합액으로 전량을 1,000 mL로 한다.

마) 이동상유량：1.0 mL/min

바) 주입량 : 10～20 μL

바. 정성시험

시험용액 및 혼합표준용액을 앞의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입하고, 얻어진 크로마토그램상의 아세설팜칼륨(acesulfame K), 사카린나트륨 및 아스파탐의 피크는 어느 측정조건에서도 혼합표준용액과 시험용액의 머무름 시간(retention time)이 일치하여야 한다.

사. 정량시험

시험용액 및 혼합표준용액을 앞의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입하고, 얻어진 피크의 높이 또는 면적으로부터 작성한 검량선을 이용하여 시험용액 중의 아세설팜칼륨(acesulfame K), 사카린나트륨 및 아스파탐의 함량을 산출한다.