3.6.1 아질산이온

가. 디아조화(diazotization)법에 의한 정량

1) 분석원리

설파닐아미드를 산성조건에서 아질산이온에 의해 디아조화한 다음, N-(1-나프틸) 에틸렌디아민과의 결합에 의해 생성된 아조색소의 자홍색을 분광광도계로 정량분석하는 방법이다.

2) 장치

가) 분석광도계

3) 시약 및 시액

가) 초산암모늄완충액 : 초산암모늄 100 g을 물 약 900 mL에 녹이고, 10% 암모니아수로 pH 9.0으로 맞춘 다음 물을 넣어 1,000 mL로 한다.

나) 설파닐아미드용액 : 설파닐아미드 0.5 g을 염산(1＋1) 100 mL에 가온하여 녹인다.

다) 나프틸에틸렌디아민용액 : N-(1-나프틸) 에틸렌디아민염산염 0.12 g을 물 100 mL에 녹이고, 불순물이 있으면 여과한다. 이 용액은 갈색병에 보관한다.

라) 아질산표준용액 : 아질산나트륨(NaNO2최순품)을 황산데시케이터에서 24시간 건조한 후 그 0.150 g을 정밀히 달아 물에 녹여 1,000 mL로 하여 표준원액으로 한다. 표준원액 10 mL에 물을 넣어 100 mL로 하고, 그 액 10 mL에 물을 넣어 100 mL로 하여 표준용액으로 한다(쓸 때 만든다).

아질산표준용액 1 mL ＝ 1.0 μg NO—2

4) 시험용액의 조제

가) 식육가공품 및 어육가공품(어육소시지)

균질화된 검체 10 g을 정밀히 달아 약 80℃의 더운물을 적당량 넣고 고르게 섞는다. 이를 200 mL의 메스플라스크에 정량적으로 옮기고, 용기는 더운물로 여러번 씻어 플라스크에 넣는다. 이 때 플라스크 중의 액량은 약 150 mL로 한다.

★ 여기에 0.5 N 수산화나트륨용액 10 mL를 넣어 잘 흔들어 섞고 다시 12% 황산아연용액 10 mL를 넣어 잘 흔들어 섞은 후 80℃의 수욕중에서 가끔 흔들어 섞으면서 20분간 가열한다. 다음 찬물에 담그어 실온이 될 때까지 식힌 후 초산암모늄완충액 20 mL와 물을 넣어 200 mL로 한다. 내용물을 잘혼화한 후 일부를 분취하여 4,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 여과(건조여지 사용)하여 얻은맑은 여액을 공전삼각플라스크에 받아 시험용액으로 한다. 따로 검체 대신에 물 10 mL를 사용하여 ★ 이하와 동일하게 조작한 액을 공시험용액으로 한다.

나) 젓갈류(명란젓, 연어알젓, 대구알염장품), 및 치즈류

가)와 동일하게 조작하며 다만 0.5 N 수산화나트륨용액 20 mL 및 12% 황산아연용액 20 mL를 사용한다.

5) 시험방법

시험용액 및 공시험용액 각 20 mL에 설파닐아미드용액 1 mL를 넣어 섞는다. 다시 나프틸에틸렌디아민용액 1 mL와 물을 넣어 25 mL로 하고 잘 섞어 발색시켜 10분간 방치한 후, 물 20 mL로 동일하게 조작한 것을 대조액으로 하여 파장 540 nm에서 흡광도 Aa, Ab를 측정한다. 시험용액이 착색되어 있을 때에는 시험용액 20 mL에 염산(1＋1) 1 mL와 물을 넣어 25 mL로 한 것을, 물을 대조액으로 하여 흡광도 Ac를 측정한다. 흡광도의 차 Aa—Ab 또는 Aa—(Ab＋Ac)를 구하여 미리 작성한 검량선에서 시험용액 20 mL 중의 아질산이온량 A(μg)를 구하고 다음 식에 따라 검체 중의아질산이온의 농도를 산출한다. 시험용액의 아질산이온 농도가 검량선의 농도범위를 벗어날 경우 농도 범위내로 희석하여 사용한다.

아질산이온(g/kg) ＝×

S : 검체의 채취량(g)

검량선의 작성∶아질산이온표준용액 0.5, 1, 5, 10 및 20 mL를25 mL의 메스플라스크에 취하고 각각의 물을 넣어 약 20 mL로 한다. 여기에 설파닐아미드용액 1 mL 씩을 넣어 섞고, 다시 나프틸에틸렌디아민 용액 1 mL씩을 넣고 물을 넣어 25 mL로 하여 잘 섞는다. 물 20 mL로 동일하게 조작한 것을 대조액으로 하여 10분후에 파장 540 nm에서 흡광도를 측정하여 검량선을 작성한다.

6) 정량한계 : 0.5 mg/kg

나. 이온크로마토그래피를 이용한 기기분석법

1) 분석 원리

시료 중의 아질산이온을 물로 추출·정제하고, 음이온 교환수지 컬럼으로 분리한 후 이온억압-전기전도도 검출기(suppressor-conductivity detector)를 장착한 이온크로마토그래프를 이용하여 정량하는 방법이다.

2) 장치

가) 정제용 카트리지

(1) 역상계(C18) 카트리지 : Onguard II RP(1 cc) 또는 이와 동등한 것(사용 전에 메탄올 10 mL 및 물 15 mL를 차례로 흘려 보낸 후 30분간 방치하여 사용한다).

(2) Ag 카트리지 : Onguard II Ag(1 cc) 또는 이와 동등한 것(사용 전에 물 10 mL를 흘려 보낸 후 30분간 방치하여 사용한다).

(3) Na 카트리지 : Onguard II Na(1 cc) 또는 이와 동등한 것(사용 전에 물 10 mL를 흘려 보낸 후 30분간 방치하여 사용한다).

나) 이온크로마토그래프/이온억압-전기전도도 검출기(suppressor-conductivity detector)

3) 시약 및 시액

가) 아질산 표준용액

아질산나트륨(NaNO2)을 황산데시케이터에서 24시간 건조한 후 1.50 g을 정밀히 달아 물에 녹여 1,000 mL로 하여 표준원액으로 한다. 이 액 10 mL에 물을 넣어 100 mL로 하여 표준용액으로 한다(쓸 때 만든다). 이 액을 0.1, 1, 5, 10 및 20 µg/mL 농도가 되도록 희석한다.

나) 9 mM 탄산나트륨용액

4) 시험용액의 조제

균질화된 검체 10 g을 정밀히 달아 약 80℃의 더운물을 적당량 넣고 고르게 섞는다. 이를 200 mL의 메스플라스크에 정량적으로 옮기고, 용기는 더운물로 여러번 씻어 플라스크에 넣는다. 이 때 플라스크 중의 액량은 약 100 mL로 한다. 80℃의 수욕중에서 가끔 흔들어 섞으면서 20분간 가열한다. 다음 찬물에 담그어 실온이 될 때까지 식힌 후 물을 넣어 200 mL로 한다. 내용물을 잘 혼화한 후 일부를 분취하여 4,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 여과(건조여지 사용)한다. 여액 15 mL를 취하여 역상계(C18) 카트리지, Ag 카트리지, Na 카트리지를 차례로 연결하여 통과시킨 다음 처음 3 mL을 버린 후 얻은 여액을 시험용액으로 한다.

5) 시험조작

가) 이온크로마토그래피 조건

(1) 컬럼

- 분석컬럼 : IonPac AS 9-HC(4.0×250 mm) 또는 이와 동등한 것

- 가드컬럼 : IonPac AG 9-HC(4.0×50 mm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상 : 9 mM 탄산나트륨용액(분석 후 필요할 경우 90 mM 탄산나트륨으로 칼럼을 세척한다)

(3) 유속 : 1.0 mL/분

(4) 주입량 : 50 μL

(5) 컬럼온도 : 30℃

(6) 서프레서 : Anion dynamically regenerated suppressor(ADRS) 600, 4 mm 또는 이와 동등한 것

(7) 검출기 : 전기전도도 검출기

나) 정량한계 : 2 mg/kg

6) 정성시험

시험용액 및 표준용액을 앞의 조건에 따라 이온크로마토그래프에 주입하고, 얻어진 크로마토그램상의 피크는 어느 측정조건에서도 표준용액과 시험용액의 머무름 시간(retention time)이 일치하여야 한다.

7) 정량시험

시험용액 및 표준용액을 각각 50 μL씩 주입하여 얻어진 피크의 높이 또는 면적으로 검량선을 작성하여 다음 식에 따라 검체 중의 아질산이온의 농도를 산출한다.

아질산이온(g/kg)＝ C ×	V
	S

C : 검량곡선에 대입하여 얻은 시험용액의 농도(mg/L)

V : 시험용액의 부피(L)

S : 검체의 채취량(g)