8.3.57 틸바로신(Tylvalosin)

1) 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

2) 분석원리

시료중분석대상물질을0.1%포름산함유 아세토니트릴으로 추출하여헥산으로 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

3) 장치

액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액: 각 표준품을메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

라) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

마) 0.1% 포름산(formic acid) 함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에포름산1 mL를 넣고아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

바) 10 mM 포름산암모늄 용액: 1,000 mL 용량플라스크에포름산암모늄(ammonium formate)0.63 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

사) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

5) 시험용액의 조제

균질화한시료5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴 용액7.5 mL를넣는다. 이를 10분간흔들어 섞은 후4℃에서 2,600G로 15분간 원심분리하여상층액 ⓐ를 취한다. 잔류물에 다시0.1% 포름산 함유 아세토니트릴 용액7.5 mL를넣고10분간흔들어 섞은 후4℃에서 2,600G로15분간 원심분리하여 상층액 ⓑ를 취한다. 새로운50 mL 원심분리관에 상층액ⓐ와 ⓑ를 합한 후 헥산 15 mL를 넣고 10분간흔들어 섞고4℃에서 2,600G로15분간 원심분리한다. 하층액을 취하여 40℃이하에서0.3 mL가 될 때까지질소농축한다.농축액에 10 mM 포름산암모늄 수용액:아세토니트릴(1:1, v/v) 혼합용액1.7 mL를넣고 흔들어 섞는다.4℃에서 15,000G로 10분간 원심분리한 후 상층액을 0.45 μmPTFE (polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 측정조건

(1) 컬럼: C18(2.0 mm × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상

(가) 이동상 A:10 mM 포름산암모늄 수용액

(나) 이동상 B: 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	90	10
3	90	10
5	10	90
13	10	90
15	90	10
20	90	10

(3) 유속: 0.25 mL/분

(4)컬럼온도: 35℃

(5) 주입량: 10 μL

나) 질량분석기 조건

(1) Ionizationmode: ESI(positive)

(2) Capillary temperature: 350℃

(3) Collision gas: N2(질소)

연번	물질명 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionizationmode)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion,m/z)	생성이온 (Product ion,m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	틸바로신 (Tylvalosin)	10.49	Positive	1041.6	1042.5	109.2	75
						174.1	59
						229.1	47
2	3-AT (3-O-Acetyltylosin)	10.07	Positive	957.5	958.6	772.0	45
						772.5	41

(4) 분석대상물질의 개별조건

※ 밑줄 표시되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

7) 정성시험

가) 정성 및 확인

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.
확인시험의 경우, 음성시료 (blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액 으로서 비교한다.

주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율 (Base peak에 대한 %)	허용범위
> 50%	± 20%
> 20%, ≤ 50%	± 25%
> 10%, ≤ 20%	± 30%

나) 표준품 크로마토그램

틸바로신

3-AT

그림 1. 틸바로신(11.2분), 3-AT(10.07분) 표준품의 크로마토그램(각 0.005 mg/L)

8) 정량시험

가) 정량

조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 5 g씩 준비한 후 음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여 표준용액을 제조한다. 각 농도별 첨가시료에서 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는면적을 구하여 검량선을 작성한 후, 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 산출된 시험용액 중 검출농도,시료량과 최종 시험용액의 부피를 고려하여 정량한다.

나) 정량한계

틸바로신(Tylvalosin): 0.002 mg/kg

3-AT(3-O-Acetyltylosin): 0.0005 mg/kg