8.3.61 브로모프로필레이트(Bromopropylate)

1) 시험법 적용범위

축산물 등(벌꿀 포함)에 적용한다.

2) 분석원리

시료중 분석대상물질을 아세토니트릴로 추출하고 C18분말로 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

3) 장치

액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액: 표준품을5 mM 포름산암모늄 함유 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.조제된표준원액은 냉동 보관한다.

라) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 5 mM 포름산 암모늄 함유 메탄올로 희석하여 사용한다.

마) 5 mM포름산암모늄(ammonium formate) 함유 메탄올: 1,000 mL 용량플라스크에포름산암모늄 315.3 mg을 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.

바) 5 mM포름산암모늄 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에포름산암모늄 315.3 mg을 넣고 물로표시선까지 채운다.

사) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

5) 시험용액의 조제

가) 꿀을 제외한 축산물

균질화한시료5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 황산마그네슘 4 g과 아세토니트릴15 mL를넣고15분간흔들어 섞은 후, 2,000G에서 10분간 원심분리한다. 새로운 원심분리관에 상층액을 취하고 C18분말 500 mg을넣고30초간흔들어 섞는다. 2,000G에서 5분간 원심분리 후 상층액 6 mL를 새로운 원심분리관에 취한 후50℃ 이하에서질소농축한다.잔류물에5 mM포름산암모늄 함유 메탄올0.4 mL를넣은 뒤0.2 μmPTFE (polytetrafluoroethylene)멤브레인필터로여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

나) 꿀

균질화한시료2 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 물 2 g을넣은 후1분간흔들어 섞는다.여기에 염화나트륨 2 g과 아세토니트릴 8 mL를넣고15분간흔들어 섞은 후, 2,000G에서 10분간 원심분리한다. 새로운 원심분리관에 상층액을 취하여 C18분말 500 mg을넣고 30초간흔들어 섞은뒤 2,000G에서 5분간 원심분리한다. 새로운 원심분리관에상층액을 모두 취하여50℃ 이하에서질소농축한다. 잔류물에5 mM 포름산암모늄 함유메탄올0.4 mL를넣은 뒤 0.2 μm PTFE (polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 측정조건

(1) 컬럼: C18(2.1 mm × 100 mm, 2.6 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상

(가) 이동상 A:5 mM포름산암모늄수용액

(나) 이동상 B:5 mM포름산암모늄 함유 메탄올

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0.0	35	65
4.0	5	95
9.0	5	95
9.1	45	65
11.5	45	65

(3) 유속: 0.3 mL/분

(4)컬럼온도: 45℃

(5) 주입량: 10 μL

나) 질량분석기 조건

(1) Ionization mode: ESI(positive)

(2) Capillary temperature: 250℃

(3) Collision gas: Ar(아르곤)

(4) 분석대상물질의 조건

물질명 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion,m/z)	생성이온 (Product ion,m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
브로모프로필레이트 (Bromopropylate)	3.7	Positive	425.9	446.0	324.8	23
					209.0	39

※ 밑줄 표시되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

7) 정성시험

가) 정성 및 확인

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.
확인시험의 경우, 음성시료 (blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액 으로서 비교한다.

주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율 (Base peak에 대한 %)	허용범위
> 50%	± 20%
> 20%, ≤ 50%	± 25%
> 10%, ≤ 20%	± 30%

나) 표준품 크로마토그램

그림 1. 브로모프로필레이트(3.7분)표준품의 크로마토그램(0.01 mg/L)

8) 정량시험

가) 정량

조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 2 g(꿀) 또는 5 g(꿀을 제외한 축산물)씩 준비한 후음성시료(blank sample)를포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여 표준용액을 제조한다. 각 농도별 첨가시료에서 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한 후, 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 산출된 시험용액중 검출농도,시료량과 최종 시험용액의 부피를 고려하여 정량한다.

나) 정량한계 브로모프로필레이트(Bromopropylate): 0.005 mg/kg