8.3.71플루랄라너(Fluralaner)

1) 시험법 적용범위

가금류고기 및 알(卵)에 적용한다.

2) 분석원리

시료중 대상성분을 1% 아세트산 포함 아세토니트릴로 추출하고, 원심분리하여 상층액을 취해 PSA(Primary Secondary Amine), C18및GCB(Graphitized Carbon Black)를이용하여정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

3) 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매:액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액:표준품을 메탄올에 녹여조제한 용액을 표준원액으로 한다.

라) 표준용액:표준원액을잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록무처리 시료 추출물로 희석하여 사용한다(무처리 시료 추출물 90% 이상 포함).

마) 기타시약:특급 또는 이와 동등한 것

5) 시험용액의 조제

가) 추출

시료를 균질화한 후 5 g을 정확히 달아50mL 원심분리관에넣고 1%아세트산함유아세토니트릴15 mL를넣고 1분간 강하게 흔들어 섞는다. 원심분리관에무수황산마그네슘6 g과 무수아세트산나트륨 1.5 g을차례로넣고10분간 강하게 흔들어 섞은 후4℃, 4,000G에서 10분간 원심분리한다.

나) 정제

새로운15 mL 원심분리관에무수황산마그네슘 1,200 mg, C18400 mg, PSA 400 mg과GCB 45 mg을 넣고‘가) 추출’로부터 얻은 용액 중상층액6mL를넣고1분간 강하게흔들어 섞은 후4℃, 4000G에서 10분간 원심분리한다.상층액중 3 mL를취하여질소 농축하고잔류물에메탄올1 mL를넣어 녹인다. 추출액을0.2μm nylon멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 분석조건

(1)컬럼:C18(2.0 mm × 50 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 컬럼 온도: 40℃

(3) 이동상

(가) 이동상 A: 0.1% 포름산 함유 메탄올

(나) 이동상 B:5 mM 아세트산암모늄 함유 0.1% 포름산 수용액

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0.0	5	95
3.0	90	10
7.0	90	10
7.1	5	95
12.0	5	95

(4) 이동상 유량: 0.2 mL/분

(5) 주입량: 5 μL

나) 질량분석기 분석조건

(1) 이온화 방법: ESI(positive)

(2)Capillary temperature: 320℃

(3)Capillary voltage: 3.7 kV

(4)Collision gas: Ar(아르곤)

물질명 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion,m/z)	생성이온 (Product ion,m/z)	충돌에너지 (Collisionenergy, eV)
플루랄라너(Fluralaner)	7.14	Positive	555.1	556	400	24
					160	38
					132	46

(5)분석대상물질의 조건

※밑줄 표시되어 있는 것은 정량이온이며, 그 외는 정성이온임

다) 검량선 작성

농도별 표준 용액을 일정량 취하여 무처리 시료 추출 용액과 각각혼합한 후액체크로마토그래프-질량분석기에각각 주입한다. 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여검량선을 작성한다.

닭고기

알(卵)

그림 1. 플루랄라너(7.2분) 표준품의 크로마토그램(0.01 mg/kg)

라) 표준품의 크로마토그램

마) 정량한계 플루랄라너(Fluralaner):0.005 mg/kg

7)정성 및 확인

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.

주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율 (Base peak에 대한 %)	허용범위
> 50%	± 20%
> 20%, ≤ 50%	± 25%
> 10%, ≤ 20%	± 30%

8) 정량시험

농도별 표준용액으로부터 얻어진 표준품 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성하고,시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 희석배수를 고려하여 정량한다.