8.3.72 루페뉴론(Lufenuron), 테플루벤주론(Teflubenzuron) 시험법

1) 시험법 적용범위

수산물 등에 적용한다.

2) 분석원리

시료중의 루페뉴론과 테플루벤주론을 아세토니트릴로 추출하고 C18흡착제로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

3) 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액: 각 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

라) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

마) 5 mM 포름산암모늄 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산암모늄 315.3 mg을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

바) 5 mM 포름산암모늄 함유 메탄올: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산암모늄 315.3 mg을 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.

사) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

5) 첨가시료의 조제

조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 2 g씩 준비한 후음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여 표준용액을 제조한다.

6) 시험용액의 조제

균질화한시료2 g을 정밀히 달아 50 mL 원심분리관에 취하고 물2 mL와 아세토니트릴 10 mL를 넣고 5분간흔들어 섞는다. 황산마그네슘 4 g과 초산나트륨 1 g을 넣고 20분간흔들어 섞은 후2,800G, 4℃에서 10분간 원심분리한다. 원심분리한 상층액을 취하여 C18100 mg이 담긴 새로운 50 mL 원심분리관에 옮기고 10분간흔들어 섞은 후2,800G, 4℃에서 10분간 원심분리한다. 원심분리한 상층액을 취하여 새로운 50 mL 원심분리관에 옮기고 50℃이하에서질소농축한다. 잔류물에물:아세토니트릴(1:1, v/v) 혼합용액2 mL를넣어 녹이고0.2 μmPTFE (polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

7) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 측정조건

(1) 컬럼: C18(2.1 mm i.d. × 150 mm, 2.6 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상

(가) 이동상 A:5 mM 포름산암모늄 함유 메탄올

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0.0	20	80
1.0	20	80
5.0	80	20
10.0	90	10
15.0	90	10
15.1	20	80
20.0	20	80

(나) 이동상 B:5 mM 포름산암모늄 수용액

(3) 유속: 0.2 mL/분

(4)컬럼온도: 40℃

(5) 주입량: 5 μL

나) 질량분석기 조건

(1) Ionization mode: ESI(positive)

(2) Capillary temperature: 250℃

(3) Capillary voltage: 4.5 kV

(4) Collision gas:Ar(아르곤)

(5) 분석대상물질의 개별조건

연번	물질명 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion,m/z)	생성이온 (Product ion,m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	루페뉴론 (Lufenuron)	8.5	Positive	510.0	511	158	23
						141	50
						113	53
2	테플루벤주론 (Teflubenzuron)	8.4	Positive	380.0	381	158	15
						141	37
						113	54

※ 밑줄 표시되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

8) 정성 및 확인시험

가) 정성 및 확인

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.
확인시험의 경우, 음성시료(blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액으로서 비교한다.

주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율 (Base peak에 대한 %)	허용범위
> 50%	± 20%
> 20%, ≤ 50%	± 25%
> 10%, ≤ 20%	± 30%

나) 표준품 첨가시료의 크로마토그램

루페뉴론

테플루벤주론

그림 1. 루페뉴론(8.5분), 테플루벤주론(8.4분) 첨가시료의 크로마토그램(각 0.005 mg/kg)

9) 정량시험

가) 정량

조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 2 g씩 준비한 후음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여 표준용액을 제조한다. 각 농도별 첨가시료에서 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한 후, 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 산출된 시험용액 중 검출농도,시료량과 최종 시험용액의 부피를 고려하여 정량한다.

나) 정량한계

루페뉴론(Lufenuron): 0.005 mg/kg

테플루벤주론(Teflubenzuron): 0.005 mg/kg