2.1.3.1 총질소 및 조단백질

가. 세미마이크로 킬달법

1) 분석원리

질소를 함유한 유기물을 촉매의 존재하에서 황산으로 가열분해하면, 질소는 황산암모늄으로 변한다(분해). 황산암모늄에 NaOH를 가하여 알카리성으로 하고, 유리된 NH3를 수증기 증류하여 희황산으로 포집한다(증류). 이 포집액을 NaOH로 적정하여 질소의 양을 구하고(적정), 이에 질소 계수를 곱하여 조단백의 양을 산출한다.

2) 장치


그림과 같은 장치를 쓴다. 전체가 경질유리를 사용하여야 하며, 접속부위는 갈아 맞춘 것으로 하여도 좋다. 장치에 쓰는 고무는 수산화나트륨시액속에서 10～30분간 끓이고, 다음에 물에서 30～60분간 끓인 다음 물로 충분히 씻어서 쓴다(다만, 동시험법의 원리를 이용한 기타의 장치 또는 자동․반자동기기를 사용할 수 있다).

A：킬달플라스크

B：수증기 발생기로서 황산 2～3방울을 넣은 물을 넣고 갑자기 끓는 것을 피하기 위하여 비등석을 넣는다.

C：알칼리용액을 넣는 깔때기

D：수증기 유도관

E：내용물이 튀어 올라오는 것을 막는다.

F：작은 구멍(관의 안지름과 거의 같다.)

G, H：갈아 맞춘 접속부위

I：냉각기(바깥지름 200 mm, 안지름 350 mm, 아래 끝은 약 5 mm)

J：흡수용플라스크

3) 시약 및 시액

가) 분해 촉진제：CuSO4, K2SO4(1：4)

나) 부런스위크(Brunswik)시액 : 메틸레드 0.2 g 및 메틸렌블루 0.1 g을 에탄올 300 mL에 녹여서 여과하여 사용하고 갈색병에 보존한다.

4) 시험방법

가) 검체의 분해

(1) 통상적으로 질소(N) 함량이 2～3 mg에 해당하는 양의 검체를 정밀히 취하여 킬달플라스크에 넣고 여기에 분해촉진제 약 0.5 g을 넣은 후 플라스크 내벽을 따라 황산 3～5 mL를 넣은 다음 플라스크를 흔들어 주면서 30% 과산화수소 1 mL를 조금씩 조심하여 넣는다.

플라스크를 금망상에서 천천히 가열하고 검체의 탄화물이 보이지 않을 때까지 온도를 높여 끓이고 분해액이 투명한 담청색이 되면 다시 1～2시간 가열을 계속한다.

분해액을 냉각시킨 후 물 20 mL를 주의하여 가한 후 이 플라스크를 증류장치에 연결한다.

(2) 비교적 많은 검체(예：건조된 식품류)를 취할 필요가 있는 경우에는 질소(N)함량이 약 20～30 mg에 해당하는 양의 검체를 정밀히 취하여 250～300 mL 킬달플라스크에 넣고 이에 분해촉진제 1～2 g 및 황산 20～30 mL를 가하여 가열분해 시킨다.

분해액을 냉각시킨 후 물 약 100 mL를 가하고 200 mL 메스플라스크에 옮겨서 냉각 후 물을 가하여 전량을 200 mL로 채워 그 20 mL를 세미마이크로 킬달플라스크에 취하여 증류장치에 연결한다.

(3) 질소(N)함량이 적어서 다량의 검체(예：사탕류, 엿류 등)를 취할 필요가 있는 경우에는 질소(N)함량 2～3 mg에 해당되는 검체를 정밀히 취하여 상기 (2)의 조작과 같이 가열 분해하고 냉각후 물 20 mL를 주의하여 가하고 킬달플라스크를 증류장치에 연결한다.

나) 증류 및 적정

증류장치의 흡수플라스크에 0.05 N 황산 10.0 mL를 취하여 이에 부런스위크시액 2～3방울을 떨어뜨려서 냉각기의 끝부분을 액면 밑에 담그고 작은 깔때기로부터 30% 수산화나트륨용액 25 mL를 가한다.

다음에 수증기 발생기로부터 수증기증류를 하여 증류액 약 100 mL를 받은 후 냉각기의 끝을 액면에서 조금 떼어 다시 증류액 수 mL를 유취하여 다시 냉각기의 끝을 소량의 물로 플라스크 내에 씻어 넣는다. 플라스크 내에 들어 있는 증류액을 0.05 N 수산화나트륨액으로 부런스위크시액이 녹색으로 변할 때까지 적정한다. 따로 같은 방법으로 공시험을 한다.

5) 계산방법

0.05 N 황산 1 mL＝0.7003 mgN

총질소(%)＝	0.7003	×	(a-b)	×	100
					검체의 채취량(mg)

a：공시험에서 중화에 소요된 0.05 N 수산화나트륨액의 mL수

b：본시험에서 중화에 소요된 0.05 N 수산화나트륨액의 mL수

계산식은 검체의 분해액을 전부 사용해서 적정했을 때의 식이므로 분해액의 일부를 사용할 때는 그 계수를 곱한다.

여기서 얻은 질소량에 다음 표에 의한 질소계수를 곱하여 조단백질의 양으로 한다.조단백질(%)＝N(%)×질소계수

식 품 명	질 소 계 수
소맥분(중등질․경질․연질․수득률(100～94%)) 소맥분(중등질․수득률(93～83%)또는 그 이하) 쌀 보리․호밀․귀리 메밀 국수․마카로니․스파게티 낙화생 콩 및 콩제품 밤․호도․깨 호박․수박 및 해바라기의 씨 원유, 유가공품, 마아가린 식육, 식육가공품, 알가공품 및 위 이외의 모든 식품	5.83 5.70 5.95 5.83 6.31 5.70 5.46 5.71 5.30 5.40 6.38 6.25

나. 단백질 분석기를 이용하는 방법

시약 및 시액, 시험용액의 조제, 시험방법 등은 분석기의 종류에 따라 변경가능하다

1) 시험법의 적용범위

총질소 및 조단백질을 측정하고자 하는 대부분의 식품에 적용가능하다.

2) 분석원리

단백질 분석기를 이용하여 검체를 황산으로 분해하고 증류하여 질소를 유리시킨 후 염산 용액으로 적정한다.

3) 장치

가) 단백질 분해장치

나) 증류 및 적정장치

4) 시약 및 시액

가) 황산

나) 분해촉진제(Kjeltabs)

다) 0.1 N 염산

라) 붕산용액 : H3BO3100g(또는 400g), 0.1% 브로모크레졸그린용액 100mL 및 0.1% 메틸레드용액 100 mL를 넣어 10 L로 정용한 1%(또는 4%) 붕산용액

마) 수산화나트륨용액 : 20% 및 40% 수산화나트륨용액

5) 시험용액의 조제(분해과정)

가) 검체 약 1g(3~25%의 단백질을 함유한 식품의 경우)을 정밀하게 취하여 분해튜브에 넣고 분해촉진제 2알을 넣는다. 분해촉진제는 H2SO4과 K2SO4의 비율이 1.4~2.0 : 1이 되어야 분해가 효율적으로 이뤄진다.

나) 분해튜브에 진한 황산 12 mL를 넣는다. 검체의 지방 함량이 10% 이상이면 진한 황산15 mL를 넣는다.

다) 420℃의 분해장치에서 45~60분간 분해하여 분해액의 색이 투명한 연푸른색(구리 촉매제를 사용한 경우) 또는 투명한 노란색(셀레늄 촉매제를 사용한 경우)이 되면 상온으로 냉각시킨다.

6) 시험방법(증류 및 적정)

자동장치인 경우 다음의 증류, 적정, 계산과정이 모두 자동으로 수행된다.

가) 분해된 시험용액에 80 mL의 증류수를 주의하여 첨가한다.

나) 25 mL의 혼합지시약이 섞인 포집용액을 삼각 플라스크에 넣은 후, 이를 증류장치에 놓고 삼각플라스크 받침대를 들어 올려준다. 증류시 증류액이 포집용액으로 들어간다.

다) 40% NaOH 50 mL(분해시 사용한 황산의 4배에 해당하는 양)를 분해튜브에 넣는다.

라) 증류장치에서 3~4분간 증류한다. 증류장치의 삼각 플라스크에 있는 포집용액이 증류액에 함유되어 있는 알칼리(암모니아)를 포집하면서 녹색으로 변한다.

마) 증류액을 염산용액(일반적으로 0.1 N 또는 0.2 N)을 이용하여 종말점이 엷은 핑크빛에 도달할 때까지 적정한다. 적정에 사용된 산의 양을 기록한다.

7) 계산방법

총질소(%) =	(HCl 소비 mL - 공시험 mL) × M × 14.01	× 100
	검체량 (mg)

조단백질(%) =	(HCl 소비 mL - 공시험 mL) × M × 14.01	× F × 100
	검체량 (mg)

14.01 : 질소의 원자량

M : HCl의 몰농도

F : 질소계수(1.1.3.1 가. 5)의 질소계수