2.1.3.3 아미노산

가. 아미노산 자동분석기에 의한 정성 및 정량

시약 및 시액, 시험용액의 조제, 시험방법 등은 분석기의 종류에 따라 변경가능하다

1) 장치

가) 단백질 가수분해 분해장치(그림 1)

나) 정온가열로：100～150℃의 온도범위에서 ±1℃로 제어 가능한 것이어야 한다.

2) 시약 및 시액

가) 6 N 염산：염산(정밀 분석용 염산 20%)을 사용한다.

나) 과개미산용액：30% 과산화수소(특), 88% 개미산(특)을 1：9의 비율로 혼합하여 실온에서 한 시간 방치 후 0℃로 냉각한다. 사용 시 제조한다.

다) 4.2 N 수산화나트륨용액：사용 시 제조한다.

라) 가용성전분：아세톤으로 세척․건조하여 사용한다.

마) 16%(w/v)삼염화초산(trichloroaetate)용액：50%(w/v)트리클로로초산을 사용 시 희석하여 사용한다. 50% 삼염화초산(trichloroaetate)용액은 냉암소에 보관한다.

바) 표준용액의 조제

아미노산 표준용액을 0.2 N 구연산나트륨 완충액(pH 2.2) 또는 0.02 N 염산용액으로 적당히 희석하여 사용한다.

3) 시험용액의 조제

가) 단백질구성 아미노산

검체는 동결건조를 한 후 분말로 하여 균질화한 것을 분석에 사용한다. 또 지방함량이 높은 검체는 동결건조 후 에테르에 침출, 탈지하여 사용한다.

(1) 시스틴, 트립토판 이외의 아미노산 정량용 시험용액

단백질로서 약 10 mg을 함유하는 검체를 가수분해 시험관에 정밀히 달아 넣는다. 0.05%(w/v) 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol)(C2H6SO)을 함유한 6 N 염산을 단백질양에 대하여 약 1,000배량 즉, 10 mL를 가한다.

드라이아이스․에탄올로 동결한 후 탈기장치에 장착하여 융해, 동결을 수회 반복하며 충분히 탈기한다. 봉관하여, 정온가열로에서 110℃±1℃, 22～24시간 가수분해한다. 가수분해 종료 후 봉관을 절단하여 즉시 감압하여 40℃에서 농축 건조하여 염산을 제거한다. 염산을 최대한 제거하기 위하여 잔사(residue)에 물을 가해 다시 농축 건조한다. 0.2 N 구연산나트륨 완충액(pH 2.2) 또는 0.02 N 염산용액으로 일정량으로 만들어 시험용액으로 한다. 침전이 있는 경우에는 막 여과지(membrane filter)를 사용하여 여과한다.

(2) 시스틴 정량용 시험용액

단백질 약 10 mg 함유하는 검체를 정밀히 달아 미리 0℃로 냉각시켜 놓은 과개미산 용액 10 mL를 가하여 단백질이 가용성인 경우 0℃에서 4시간, 불용성인 경우 0℃에서 하루 밤 방치한다. 방치 후 공기를 흡입하고 소량의 물을 가해 동결 건조한다. 잔사(residue)를 0.05%(v/v) 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol) 함유의 6 N 염산 10 mL를 사용하여 가수분해 시험관으로 옮긴다. 동결한 후, 탈기장치에 장착하여 충분히 탈기한 후 봉관하여 110±1℃에서 18시간 분해한다. 이하 방법은 (1) 시스틴, 트립토판 이외의 아미노산 정량용 시험용액에 따라 시험용액을 조제한다.

A：드라이아이스․에탄올 B：가수분해용 시험관 C：진공코오드 D：트랩 E：마노메타 F：펌프

그림 1. 단백질 가수분해장치

(3) 트립토판 정량용 시험용액

단백질 10 mg을 함유하는 검체를 가수분해 시험관에 정밀히 달아 넣고, 가용성전분 100 mg을 가한 다음 4.2 N 수산화나트륨용액 3 mL를 가한다. 동결시킨 후, 탈기장치에 장착하여 충분히 탈기하고 밀봉하여 135±1℃에서 22시간 가수분해한다. 가수분해 후 봉관을 잘라 열고 6 N 염산으로 중화하여 0.2 N 구연산나트륨완충액(pH 4.25)으로 일정량을 만들어 시험용액으로 한다. 용액이 탁한 경우 30,000～40,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 상등액을 취한다.

나) 유리 아미노산

(1) 물에 의한 추출법

고체 또는 페이스트(paste) 검체에 적용된다.

균질한 검체 약 1 g을 정밀히 달아 약 10배량을 물을 가해 비등 수욕상에서 가열하여 응고시킨 다음 여과하여 물층을 취한다. 잔사(residue)는 2～3회 소량의 물로 세정하고, 세액은 앞서의 물과 합한다. 지방이 있는 경우에는 에테르로 추출하여 제거한다.

물층을 감압하에 농축 건조하여 얻은 잔사(residue)를 0.2 N 구연산나트륨 완충액(pH 2.2) 또는 0.02 N 염산으로 용해하여 일정량으로 하여 시험용액으로 한다. 불용물질이 있는 경우에는 막 여과지(membrane filter)를 사용하여 여과한다.

(2) 삼염화초산(trichloroaetate)법

액체상의 검체에 적용한다.

검체 1.0～3.0 mL를 시험관에 달아 16% 삼염화초산(trichloroaetate)용액을 동용량 가하여 15분간 진탕한다. 3,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액을 시험용액으로 한다.

4) 시험방법

가) 아미노산 자동분석기 조건

완충액, 발색시약의 유무, 칼럼오븐의 온도를 점검하고, 자동완충액 전환기구 및 정유량 펌프, 유량을 소정의 조건에 따라 설정하고 측정을 실시한다.

5) 정성시험

정성분석을 위하여 표준물질과 시험용액을 동일한 조건에서 분석하여 머무름 시간이 일치하는 성분을 비교 동정한다.

6) 정량시험

정량분석의 경우에는 미리 구해 놓은 농도의 아미노산표준의 피크 면적과 함량으로부터 검량 곡선을 작성한 다음 시험용액으로부터 얻어진 피크면적으로 시험용액중의 아미노산 함량을 계산한다.
 

나. 액체크로마토그래프에 의한 정성 및 정량

제8. 일반시험법 2.1 일반성분시험법 2.1.3 질소화합물 2.1.3.3 아미노산 2.1.3.3 가. 아미노산 자동분석기에 의한 정량 및 정성에서와 같이 시험용액을 준비한다. 각각의 액체크로마토그래프에서 주어진 조건에 맞추어 유도체를 만든 후 검체와 동일 조건하에 조제한 아미노산표준용액의 피크면적과 함량으로부터 검량곡선을 작성하고 시험용액에서 얻어진 피크면적으로 시험용액중의 아미노산 함량을 계산한다.