2.1.3.4 단백질 분자량

가. 장치

분자량 측정은 액체크로마토그래프를 사용하여 아래의 조건에 의해 측정한다.

나. 시약 및 시액

1) 단백질표준품

가) 난알부민(ovalbumin) 50,000 나) 트립신(trypsin) 24,000 다) 리보뉴클레아제(ribonuclease) A 13,700 라) 뉴로텐신(neurotensin) 1,673 마) 류신 엔케팔린(leucine enkephalin) 555.6

각각의 적당량을 취해 이동상 약 1 mL를 가해 용해하고 각각의 표준용액으로 한다.

다만, 검량선의 조작에 대해서 표준품으로서 분자량 50,000으로 표시된 난알부민 사용을 필수로 한다.

다. 시험용액의 조제

검체의 적정량을 달아 이동상 40 mL를 사용하여 용해하고 이동상을 더 가해 50 mL로 하고 0.45 μm의 막 여과지(membrane filter)에 통과시켜 시험용액으로 한다.

주) 검체 중의 단백질분해물이 이동상에 용해하지 않는 경우는 SDS(Sodium Dodecyl Sulfate) 1%를 이동상에 가해 사용한다.

라. 시험방법

표준용액 및 검체용액 10 μL로 하기 액체크로마토그래프 조건에 따라 시험한다.

1) 액체크로마토그래프 조건

가) column∶내경 7.8 mm, 길이 300～600 mm의 스테인리스관에 충전제로서 thiol화한 10 μm의 실리카겔(protein pak 125)을 충전한 것 또는 이와 동등한 기능을 가진 것을 사용한다(분자량 60,000이하가 분리 가능한 것).

나) 이동상∶0.5M K2HPO4＋0.5M KH2PO4pH 7.4

다) 유속∶0.5 mL/min

라) 검출∶UV 280 nm

마) 온도∶실온

2) 규격성분의 함량∶검체 중의 규격성분 함량을 얻어진 피크면적의 수치를 사용하여 다음 식에 의해 계산한다.

분자량 50,000 이하의 단백질 함량(%)＝검체중의 조단백질 함량(%) × 분자량 50,000 이하의 성분의 피크면적 수치의 합/전용출성분의 피크면적 수치의 총합