2.1.5.4 지방산

가. 제1법

1) 시험법 적용범위

식용유지류에 적용한다.

2) 분석원리

유지를 메탄올성 수산화나트륨용액으로 처리하여 알칼리염을 만든 후 트리플루오로보란메탄올 용액을 가하고 가열하여 에스테르화 한다. 생성된 지방산에스테르를 이소옥탄(isooctane)에 녹여 분석을 행한다. 개별 지방산의 함량 및 대표적인 지방산의 합을 계산하여 포화지방, 단일불포화지방, 다중불포화지방 함량을 분석한다.

3) 장치

가) 기체크로마토그래프 : 불꽃이온화검출기(Flame Ionization Detector, FID)

나) 교반기(vortex mixer)

다) 가열기(heating block)

라) 질소농축기

4) 시약 및 시액

가) 14% 트리플루오로보란메탄올 용액(125 g BF3/L MeOH)

나) 메탄올성 수산화나트륨용액(0.5 N) : 수산화나트륨 2 g을 메탄올 100 mL로 조제한다. 장시간 방치하는 경우 흰 침전(탄산나트륨)이 생길 수 있으나 이는 무시하여도 된다.

다) 이소옥탄

라) 무수황산나트륨

마) 포화 염화나트륨용액

바) 내부표준용액 : 내부표준용액의 농도는 지방산 표준용액의 감응도(피크의 면적 또는 높이)보다 높게 조절한다.

(1) 지방산 사용시 : Triundecanoin(C11:0)을 이소옥탄에 녹여 사용한다.

(2) 지방산 메틸 에스테르 사용시 : Undecanoic acid methyl ester를 이소옥탄에 녹여 사용한다.

사) 표준용액의 조제

(1) 지방산 사용 시 : 분석하고자 하는 지방산 0.01 g을 이소옥탄 10 mL에 녹여 표준원액으로 한다(1 mg/mL). 지방산 표준원액을 적절한 농도로 희석한 표준용액 1 mL를 유리 튜브에 취하고 내부표준용액 1 mL를 첨가한다. (단, 표준용액과 시험용액의 내부표준물질 농도가 동일한 농도가 되도록 조절한다.) ★이어 0.5 N 메탄올성 수산화나트륨용액 1.5 mL를 가하고 질소를 불어넣은 후 즉시 뚜껑을 덮고 혼합한다. 이어 100℃ heating block에서 약 5분간 가온한다. 이를 냉각한 후 14% 트리플루오로보란메탄올 용액 2 mL를 가하고 다시 질소를 불어넣은 후 즉시 뚜껑을 덮고 혼합하고 100℃에서 30분간 가온한다. 이어 30～40℃로 냉각하여 이소옥탄 1 mL를 가하여 질소를 불어넣은 후 뚜껑을 덮고 이 온도에서 30초간 격렬히 진탕한다. 다음 즉시 포화 염화나트륨용액 5 mL를 가하고 질소를 불어넣은 후 뚜껑을 덮고 진탕한다. 상온으로 냉각한 후 수층으로부터 분리된 이소옥탄층을 무수황산 나트륨으로 탈수하여 표준용액으로 한다.

(2) 개별 지방산 메틸 에스테르 사용 시 : 분석하고자 하는 지방산 메틸 에스테르를 이소옥탄에 녹여 표준원액으로 한다(1 mg/mL). 표준원액을 적절한 농도로 희석한 용액 1 mL에 바) 내부표준용액 (2) 1 mL를 첨가하여 표준용액으로 한다.

(3) 혼합 지방산 메틸 에스테르(FAME mixture 37종)사용 시 : 36종 지방산 메틸 에스테르
1)에 내부표준물질 메틸 에스테르가 포함된 표준용액을 사용한다.

1) C4:0-tetranoic methyl ester, C6:0-hexanoic methyl ester, C8:0-octanoic methyl ester, C10:0-decanoic methyl ester, C12:0-dodecanoic methyl ester, C13:0-tridecanoic methyl ester, C14:0-tetradecanoic methyl ester, C14:1-9-tetradecenoic methyl ester, C15:0-pentadecanoic methyl ester, C15:1-10-pentadecenoic methyl ester, C16:0-hexadecanoic methyl ester, C16:1-9-hexadecenoic methyl ester, C17:0-heptadecanoic methyl ester, C17:1-10-heptadecenoic methyl ester, C18:0-octadecanoic methyl ester, C18:1-elaidic methyl ester, C18:1-9-octadecenoic methyl ester, C18:2-6-linolelaidic methyl ester, C18:2-9,12-octadecadienoic methyl ester, C18:3-9,12,15-octadecatrienoic methyl ester, C18:3-6,9,12-octadecatrienoic methyl ester, C20:0-eicosanoic methyl ester, C21:0-heneicosanoic methyl ester, C20:1-8-eicosenoic methyl ester, C20:2-11,14-eicosadienoic methyl ester, C20:3-8,11,14-eicosatrienoic methyl ester, C20:3-11,14,17-eicosatrienoic methyl ester, C20:4-arachidonic methyl ester, C20:5-eicosapentaenoic methyl ester, C22:0-docosanoic methyl ester, C22:1-9-docosaenoic methyl ester, C22:2-docosadienoic methyl ester, C22:6-docosahexaenoic methyl ester, C23:0-tricosanoic methyl ester, C24:0-lignoceric methyl ester, C24:1-nervonic methyl ester

5) 시험용액의 조제

검체 약 25 mg을 유리 튜브에 정밀히 취하고 내부표준용액 1 mL를 첨가한다. 사) 표준용액 (1) 지방산 사용시 ★ 이하에 따라 시험하여 시험용액으로 한다.

6) 시험방법

가) 기체크로마토그래프 조건

지방산 분석시 C18:3(Linolenic acid, n3 cis)과 C20:1(Eicosenic acid) 및 C22:1(Docosaenoic acid), C20:3(Eicosatrienoic acid)와 C20:4(Arachidonic acid)의 분리도는 1.0 이상이여야 한다.

(1) 칼럼 : SP-2560 (100 m ⨉ 0.25 mm ⨉ 0.2 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 주입부온도 : 225℃

(3) 칼럼온도 : 100℃에서 4분간 유지한 후 3℃/min의 비율로 240℃까지 온도를 상승시키고 이후 15분 이상 유지한다.

(4) 검출기온도 : 285℃

(5) 유량 : 헬륨 0.75 mL/min

(6) split ratio : 200 : 1

나) 지방산 표준물질의 크로마토그램

C18:1(Elaidic acid)과 C18:2(Linolelaidic acid)의 트랜스형의 이성체의 표준물질을 포함한 37종의 지방산 메틸 에스테르 표준물질의 크로마토그램은 그림 1과 같다. 통상적으로 트랜스형의 이성체는 시스형보다 먼저 분리된다. C18:3(Linolenic acid, n3, cis)과 C20:1(Eicosenic acid)의 피크 순서는 칼럼의 종류 및 분석온도에 따라 상이하며 트랜스지방산의 분리조건을 최적화시키는 데에는 C20:1(Eicosenic acid)의 피크가 C18:3(Linolenic acid, n3, cis)의 바로 앞에 나오는 것이 좋다(SP-2560의 경우, 그림 1)

다) 지방산 전환계수

GC-FID상에서의 분석은 각 지방산의 메틸 에스테르이므로 해당 지방산으로 전환해야 한다. 각 지방산별 전환계수는 8)정량시험 표 1.과 같다. 트랜스형의 지방산인 경우 동일한 분자량을 갖는 시스형 지방산의 경우와 동일한 전환계수를 사용한다.

라) 부분 경화유 중 트랜스지방 크로마토그램

부분 경화유의 크로마토그램 중 트랜스지방의 검출시간은 그림 2.와 같다.

그림 2. 부분 경화유의 크로마토그램

7) 정성시험

시험용액 및 지방산표준용액을 각각 1～2 μL를 주입하여 RRT (Relative Retention Time; 내부표준물질에 대한 각 지방산들의 머무름 시간의 비)를 사용하여 각각의 지방산을 확인한다.

8) 정량시험

정성시험법에 의해 얻은 각 지방산의 피크면적, 내부표준물질의 피크면적으로부터 다음과 같이 정량을 한다.

가) 개별 지방산 메틸 에스테르의 함량 계산

WFAMEi	=	Pti×WtC11:0×1.0067
		PtC11:0×Ri

WFAMEi: 지방산 i의 메틸 에스테르로서의 양(mg)

Pti: 시험용액 중 지방산 i의 피크면적

WtC11:0: 시험용액 중 내부표준물질(C11:0triundecanoin) 첨가량(mg)

1.0067 : 내부표준물질(C11:0triundecanoin)의 트리글리세라이드로부터 지방산 메틸 에스테르로의 전환계수

PtC11:0: 시험용액 중 내부표준물질(undecanoic acid methyl ester)의 피크면적

Ri: 지방산 i의 반응계수(response factor)

※ Ri	=	Psi	×	WC11:0
		PsC11:0		Wi

Psi: 표준용액 중 지방산 메틸 에스테르 i의 피크면적

PsC11:0: 표준용액 중 내부표준물질(undecanoic acid methyl ester)의 피크면적

WC11:0: 표준용액 중 내부표준물질(undecanoic acid methyl ester)의 양(mg)

Wi: 표준용액 중 지방산 메틸 에스테르 i의 양(mg)

나) 개별 지방산 및 지방 함량 계산

(1) 개별 지방산

지방산(g/100 g)	=	WFAi× 100
		Wspl

WFAi= WFAMEi×fFAi

fFAi: 지방산 i(메틸 에스테르로서)의 지방산 전환계수(표 1.)

Wspl: 검체량(mg)

(2) 포화지방

포화지방(g/100 g)	=	Σ 포화지방산i× 100
		Wspl

포화지방산i : C4:0(Butyric acid), C6:0(Carproic acid), C8:0(Caprylic acid) 등 이중결합이 없는 지방산

(3) 단일불포화지방

단일불포화지방(g/100 g)	=	Σ 단일불포화지방산i× 100
		Wspl

단일불포화지방산i : C16:1(Palmitic acid), C17:1(Margaroleic acid), C18:1(Oleic acid) 등 하나의 시스형 이중결합이 있는 지방산

(4) 다중불포화지방

다중불포화지방(g/100 g)	=	Σ 다중불포화지방산i× 100
		Wspl

다중불포화지방산i : C18:2(Linoleic acid), C18:3(Linolenic acid), C20:2(Eicosadienoic acid) 등 시스형 이중결합이 두 개 이상인 지방산

(5) 트랜스지방

트랜스지방(g/100 g)	=	Σ 트랜스지방산i× 100
		Wspl

트랜스지방산i : C18:1(Elaidic acid), C18:2(Linolelaidic acid) 등 트랜스 구조를 1개 이상 가지고 있는 모든 불포화지방산을 말한다. 이중결합이 2개 이상일 때에는 메틸렌기에 의해 분리되거나 또는 비공액형의 이중결합을 가지고 있는 지방산으로 한정한다.

표 1. 각 지방산 Methyl ester의 지방산 전환계수
지방산명		fFAi
C4:0	Butyric acid	0.8627
C6:0	Caproic acid	0.8923
C8:0	Caprylic acid	0.9114
C10:0	Capric acid	0.9247
C11:0	Undecanoic acid	0.9300
C12:0	Lauric acid	0.9346
C13:0	Tridecanoic acid	0.9386
C14:0	Myristic acid	0.9421
C14:1	Tetradecenenoic	0.9417
C15:0	Pentadecanoic acid	0.9453
C15:1	Pentadecenoic acid	0.9449
C16:0	Palmitic acid	0.9481
C16:1	Hexadecenoic acid	0.9477
C17:0	Margaric acid	0.9507
C17:1	Margaroleic acid	0.9503
C18:0	Stearic acid	0.9530
C18:1	Octadecenoic acid	0.9527
C18:2	Octadecadienoic acid	0.9524
C18:3	Linolenic acid	0.9520
C20:0	Arachidic acid	0.9570
C20:1	Eicosenic acid	0.9568
C20:2	Eicosadienoic acid	0.9565
C20:3	Eicosatrienoic acid	0.9562
C20:4	Arachidonic acid	0.9560
C20:5	Eicosapentaenoic acid	0.9557
C21:0	Heneicosanoic acid	0.9588
C22:0	Behenic acid	0.9604
C22:1	Docosaenoic acid	0.9602
C22:2	Docosadienoic acid	0.9600
C22:3	Docosatrienoic acid	0.9598
C22:4	Docosatetraenoic acid	0.9595
C22:5	Docosapentaenoic acid	0.9593
C22:6	Docosahexaenoic acid	0.9590
C23:0	Tricosanoic acid	0.9620
C24:0	Lignoceric acid	0.9563
C24:1	Nervonic acid	0.9632

나. 제2법

1) 시험법 적용범위

식품 등에 적용한다.

2) 분석원리

식품 중 지방 및 지방산을 산분해 및 염기분해하여 에테르로 추출하고 트리플루오로보란메탄올 용액으로 지방산을 메틸 에스테르화하여 가스크로마토그래프로 분석한다. 개별 지방산의 함량 및 대표적인 지방산의 합을 계산하여 포화지방, 단일불포화지방, 다중불포화지방 함량을 분석한다.

3) 장치

가) 기체크로마토그래프 : 불꽃이온화검출기(Flame Ionization Detector, FID)

나) 교반기(vortex mixer)

다) 수조(shaking water bath)

라) 원심분리기(centrifuge)

마) 가열기(heating block)

바) 질소농축기

사) 드라이오븐

4) 시약 및 시액

가) 피로갈롤(Pyrogallol)

나) 8.3 M 및 12 M 염산 용액: 8.3 M의 염산 용액을 제조할 경우, 12 M 염산 용액 250 mL를 물 110 mL에 용해하고 혼합하여 사용한다.

다) 수산화암모늄 용액 : 28∼30%(w/w)

라) 디에틸에테르

마) 무수 석유에테르(Petroleum ether)

바) 에탄올

사) 톨루엔

아) 클로로포름

자) 무수 황산나트륨

차) 7% 트리플루오로보란메탄올 용액: 14% 트리플루오로보란메탄올 용액을 메탄올로 희석하여 사용한다.

카) 헥산

타) 내부표준용액 : 내부표준용액의 농도는 지방산 표준용액의 감응도(피크의 면적 또는 높이)보다 높게 조절한다.

(1) 지방산 사용시 : Triundecanoin(C
11:0)을 클로로포름에 녹여 사용한다.

(2) 지방산 메틸 에스테르 사용시 : Undecanoic acid methyl ester를 클로로포름에 녹여 사용한다.

파) 표준용액의 조제

(1) 지방산 사용 시 : 분석하고자 하는 지방산 0.01 g을 클로로포름 10 mL에 녹여 표준원액으로 한다(1 mg/mL). 지방산 표준원액을 적절한 농도로 희석한 표준용액 1 mL를 15mL 시험관에 취하고 내부표준용액 1 mL를 첨가한다. (단, 표준용액과 시험용액의 내부표준물질 농도가 동일한 농도가 되도록 조절한다.) 시험관에 2～3 mL 클로로포름과 2～3 mL 디에틸에테르를 넣어 혼합한 후 ★40℃ 수조에서 질소 농축하고 2 mL 7% 트리플루오로보란메탄올 용액과 1 mL의 톨루엔을 첨가한다. 테프론/실리콘 재질의 마개로 잘 밀봉하여 100℃ 오븐에서 45분간 가열한 후 실온으로 냉각한다. 5 mL 물, 1 mL 헥산 및 약 1 g 무수 황산나트륨를 첨가한 후 진탕하여 정치하고 분리된 상층액을 취하여 약 1 g의 무수 황산나트륨을 담은 다른 바이알(Vial)에 넣고 탈수한 후 표준용액으로 한다.

(2) 개별 지방산 메틸 에스테르 사용 시 : 분석하고자 하는 지방산 메틸 에스테르를 클로로포름에 녹여 표준원액으로 한다(1 mg/mL). 표준원액을 적절한 농도로 희석한 용액 1 mL에 타) 내부표준용액 (2) 1 mL를 첨가하여 표준용액으로 한다.

(3) 혼합 지방산 메틸 에스테르(FAME mixture 37종)사용 시 : 36종 지방산 메틸 에스테르에 내부표준물질 메틸 에스테르가 포함된 표준용액을 사용한다.

5) 지방 추출

지방 추출에 앞서 검체를 균질화한다. 내부표준물질로 사용하는 undecanoic acid에 대한 간섭을 확인하기 위하여 내부표준물질 없이 시험용액을 조제하여 분석하고 해당 피크가 발견되면 내부표준물질 피크면적을 계산 시 보정한다. 이를 위해 내부표준용액 대신 클로로포름 1 mL을 사용한다.

가) 우유 등 유제품 및 치즈를 제외한 식품

균질화된 검체를 약 50～100 mg의 지방을 포함하는 양으로 정확히 칭량하여 시험관에 넣고 약 50 mg의 피로갈롤을 첨가한 후, 1 mL의 내부표준용액을 첨가한다. 시험관에 끓임쪽을 넣고 1 mL 에탄올을 첨가하여 혼합한다. 8.3 M 염산용액 5 mL를 넣고 혼합한다. 시험관의 마개를 테프론테이프로 밀봉한 후, 70～80℃의 수조에서 적당한 속도로 교반하면서 40분간 분해한다. 시험관의 벽면에 붙어있는 입자들이 잘 혼합될 수 있도록 매 10분마다 교반기로 혼합한다. 분해 후, 실온으로 냉각하고 에테르 추출 시 분액이 용이하도록 에탄올 2 mL를 첨가하여 혼합한다.

나) 우유 등 유제품

균질화된 검체를 약 50～100 mg의 지방을 포함하는 양으로 정확히 칭량하여 시험관에 넣고 약 50 mg의 피로갈롤을 첨가한 후, 1 mL의 내부표준용액을 첨가한다. 시험관에 끓임쪽을 넣고 1 mL 에탄올을 첨가하여 혼합한다. 2 mL의 물, 1 mL의 수산화암모늄 용액을 첨가하여 교반하고 시험관의 마개를 테프론테이프로 밀봉한 후, 70～80℃의 수조에서 적당한 속도로 교반하면서 10분간 분해한다. 시험관의 벽면에 붙어있는 입자들이 잘 혼합될 수 있도록 매 5분마다 교반기로 혼합한다. 분해 후 페놀프탈레인 용액을 몇 방울 넣고 염기성(분홍색)이 유지될 수 있도록 수산화암모늄 용액을 첨가한다. 에테르 추출 시 분액이 용이하도록 에탄올 2mL를 첨가하여 혼합한다.

다) 치즈

균질화된 검체를 약 50～100 mg의 지방을 포함하는 양으로 정확히 칭량하여 시험관에 넣고 약 50 mg의 피로갈롤을 첨가한 후, 1 mL의 내부표준용액을 첨가한다. 시험관에 끓임쪽을 넣고 1 mL 에탄올을 첨가하여 혼합한다. 2 mL의 물, 1 mL의 수산화암모늄 용액을 첨가하여 교반하고 시험관의 마개를 테프론테이프로 밀봉한 후, 70～80℃의 수조에서 적당한 속도로 교반하면서 20분간 분해한다. 시험관의 벽면에 붙어있는 입자들이 잘 혼합될 수 있도록 매 5분마다 교반기로 혼합한다. 12 M 염산용액 5 mL를 추가하여 첨가하고 20분간 분해한다. 시험관의 벽면에 붙어있는 입자들이 잘 혼합될 수 있도록 매 10분마다 교반기로 혼합한다. 에테르 추출 시 분액이 용이하도록 에탄올 2mL를 첨가하여 혼합한다.

라) 에테르 추출

가), 나) 및 다)에서 준비된 시험관의 분해물에 12.5 mL 디에틸에테르를 첨가하고 5분간 진탕하여 추출한다. 12.5 mL의 무수 석유에테르를 추가하여 5분간 다시 진탕 추출하고 50 ⨉ g에서 5분간 원심분리한다. 원심분리가 어려울 경우, 상층이 깨끗해질 때까지 적어도 1시간 이상 방치하여 분리한다. 15 mL 시험관에 에테르 층을 분액한 후 질소를 사용하여 35～40℃ 수조에서 에테르를 천천히 증발시킨다.

6) 시험용액의 조제

시험관에 2～3 mL 클로로포름과 2～3 mL 디에틸에테르를 첨가해 추출한 지방을 녹인 후 4) 시약 및 시액 파) 표준용액 (1) 지방산 사용시 ★ 이하에 따라 시험하여 시험용액으로 한다.

7) 시험방법

2.1.5.4. 가. 제1법 6) 시험방법에 따라 시험한다.

8) 정성시험

2.1.5.4. 가. 제1법 7) 정성시험에 따라 시험한다.

9) 정량시험

2.1.5.4. 가. 제1법 8) 정량시험에 따라 시험한다.