2.1.5.5 콜레스테롤

가. 시험법 적용범위

지질을 함유한 식품 등에 적용한다.

나. 분석원리

검체 중 지질을 고온에서 수산화칼륨 에탄올 용액으로 비누화한다. 콜레스테롤을 헥산으로 추출하고 트리메틸실릴(TMS) 에테르화하여 유도체화한 후, 이를 기체크로마토그래프로 정량한다.

다. 장치 및 기구

1) 장치

기체크로마토그래프/불꽃이온화검출기(GC-FID)

2) 기구

가) 원심분리관 : 15 mL, Pyrex No. 13.

※ 유도체화를 위해서 원심분리관을 실란화하여 사용한다. 이를 위해 원심분리관을 시판되는 실란화 시약으로 제품별 절차에 따라 처리한 후 사용한다. 원심분리관을 재사용하기 전에 물, 에탄올, 헥산 및 아세톤으로 세척하고 100℃ 오븐에 건조하여 사용한다. 강 알칼리로 시험관을 세척한 것이 아니라면 실란화를 다시 하지 않고 시험관을 다시 사용할 수 있으나 적어도 6개월에 한번은 실란화하여 사용한다.

나) 감압 농축기

다) 자석교반-가열기

라) 교반기(Vortex mixer)

마) 초자기구 :둥근바닥플라스크(250 mL), 부피 플라스크, 피펫, 메스실린더, 분액여두(500 mL)

라. 시약 및 시액

1) 디메틸포름아미드(dimethyl formamide, DMF) : 기체크로마토그래프용

2) 헥사메틸디실라잔(Hexamethyldisilazane)

3) 5α-콜레스탄(Cholestane) 내부표준용액 : 1 mg/mL, 5α-콜레스탄(Cholestane) 100 mg을 n-헥산에 녹여 100 mL로 한다.

4) 콜레스테롤 표준원액 : 2.0 mg/mL, 콜레스테롤 20 mg을 n-헥산에 녹여 10 mL로 한다.

5) 콜레스테롤 표준용액 : 콜레스테롤 표준원액을
n-헥산으로 희석하여 0.0025～0.2 mg/mL 범위에서 6개 농도를 조제한다(0.0025, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2 mg/mL로 조제한다.)

6) 수산화칼륨 용액 :

가) 50%(w/v), 500 g 수산화칼륨을 증류수를 가하여 1 L로 조제한다.

나) 1M, 56 g 수산화칼륨을 증류수를 가하여 1 L로 조제한다.

다) 0.5M, 1M 수산화칼륨 용액을 증류수로 희석하여 조제한다.

7) 트리메틸클로로실란(Trimethyl chlorosilane)

8) 헥산(n-Hexane) : 잔류농약급 또는 이와 동등한 것

9) 무수황산나트륨

10) 헵탄

마. 시험용액의 조제

1) 비누화 과정

검체 약 2g을 정밀히 칭량하여 둥근바닥플라스크에 취한다. 이때 검체의 지방량은 1 g이하가 되도록 검체량을 조절한다.(예, 저지방마가린을 제외한 식용유지류는 1 g, 마요네즈는 1.5 g을 취한다). 자석막대(마그네틱바)를 둥근바닥플라스크에 넣고 내부표준물질 용액 1.2 mL, 95% 에탄올 40 mL과 8 mL 50% 수산화칼륨용액을 가한다(95% 에탄올 40 mL 중 일정량을 50% 수산화칼륨용액 첨가 후 잔류물 세척에 사용하여 플라스크와 콘덴서가 같이 붙어서 떨어지지 않는 것을 방지할 수 있다). 콘덴서를 설치하고 자석교반-가열기를 이용하여 교반하면서 가열하여 70±10분간 환류시킨다. 비누화를 위해 시료를 지속적으로 관찰하면서 덩어리가 생길 경우 유리봉으로 분산시키거나 교반하면서 50% 수산화칼륨용액을 추가하여 시험용액을 교반한다. 환류가 완료되면 가열기를 끄고 교반 중에 콘덴서의 상부를 통해 95% 에탄올 60 mL을 조심하여 첨가한다. 약 15분 후, 콘덴서를 플라스크에서 제거하고 플라스크에 마개를 막아 실온으로 냉각시킨다.

2) 추출

비누화가 끝난 시험용액을 500mL 분액여두로 옮기고 헥산 100 mL를 첨가하고 소량의 헥산으로 둥근바닥플라스크에 남아있는 잔류물을 씻어 분액여두에 합한다. 110 mL 1M 수산화칼륨용액을 분액여두에 넣고 10초간 강렬하게 진탕하여 정치하고 분리된 아래층을 버린다. 40 mL 0.5 M 수산화칼륨용액을 분액여두에 넣고 분액여두를 뒤집은 후 천천히 내용물이 소용돌이가 생기도록 10초간 섞어준 후 정치하여 분리된 아래층을 버린다.

헥산 층을 40 mL 증류수로 천천히 분액여두를 돌려주며 수세한다. 정치하여 분리된 아래층을 버리고 수세과정을 3회 이상 반복한다. 이 때 수세과정이 반복될수록 더욱 강렬하게 진탕한다. 만약 에멀젼이 발생하면 소량의 95% 알코올을 첨가하여 분액여두의 내용물이 회오리가 생기도록 섞어준 후 정치하여 층을 분리한다. 헥산 층이 맑게 보일 때까지 수세과정을 계속한다.

약 20 g의 무수황산나트륨을 여과지(Silicon treated filter paper)에 넣고 유리깔때기를 통해 수세한 헥산을 둥근바닥플라스크로 흘려주고, 추가로 분액여두에 남아있는 잔류물에 소량의 헥산을 가하여 흘려주어 탈수한다. 추출한 헥산 층을 40±3 ℃에서 약 80 mL로 감압 농축한 후 농축액을 매스실린더에 옮기고 용기를 헥산으로 씻어 전량을 100 mL로 한다. 이 액 25 mL를 둥근바닥플라스크에 취하고 이를 40±3 ℃에서 감압 농축하여 완전 건고한다. 잔류물을 3 mL 디메틸포름아미드(dimethyl formamide, DMF)에 녹여 시험용액으로 한다. 시험용액의 농도는 콜레스테롤 표준용액의 농도범위 안에 있어야 한다.(정량한계는 0.01 mg/g이다.)

3) 유도체화

6개 농도의 콜레스테롤 표준용액 1.0 mL와 내부표준물질용액 0.1 mL을 원심분리관에 넣고 질소 건조 후 잔류물을 1 mL 디메틸포름아미드(dimethyl formamide, DMF)로 녹여 유도체화를 위한 표준용액으로 한다. 따로 시험용액 1.0 mL을 원심분리관에 취한다. 표준용액 및 시험용액에 헥사메틸디실라잔 0.2 mL을 가한 후 트리메틸클로로실란 0.1 mL를 가하여 마개를 닫고 이를 강렬하게 30초간 교반하거나 손으로 흔들어 혼합하고 15분간 정치한다. 각각의 원심분리관에 헵탄 1.0 mL과 증류수 10 mL를 넣은 후 마개를 닫고 30초간 강렬하게 교반하고 이를 1,600 × g에서 2분간 원심분리한다. 상층의 헵탄 층을 취하여 기체크로마토그래프 측정용 시험용액으로 한다. 이 때 유도체화된 표준용액과 시험용액은 24시간 내에 분석한다.

바. 시험방법

1) 기체크로마토그래프의 측정조건

가) 칼럼 : HP-5(25m×0.32mm×0.17um) 또는 이와 동등 제품(5%-phenyl-methyl polysiloxane)

나) 검출기 : FID(불꽃이온화 검출기)

다) 주입부의 온도 : 250℃, split

라) 검출기의 온도 : 300℃

마) 오븐온도 : 190℃에서 2분간 유지하고 20℃/min의 비율로 230℃까지 상승시켜 3분간 유지하고 40℃/min로 270℃까지 상승시켜 25분간 유지한다.

바) 캐리어 가스 : 질소 또는 헬륨

사) 유속 : 2.0 mL/min

2) 검량선의 작성

유도체화한 6개의 콜레스테롤 표준용액을 1 uL 취하여 기체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 콜레스테롤 피크면적을 5α-콜레스탄(Cholestane) 피크면적으로 나눈 값(Y축)과 콜레스테롤 농도(mg/mL, X축)로 검량선을 작성한다. 이 때 시험용액의 농도에 따라 0.01～0.2 mg/mL 범위의 고농도 콜레스테롤 표준용액 4개를 이용하여 검량선을 작성하거나 0.0025～0.05 mg/mL 범위의 저농도 콜레스테롤 표준용액 4개를 이용하여 검량선을 작성할 수 있다.

3) 표준품의 크로마토그램

분석에 사용한 칼럼에 특성에 따라 5α-콜레스탄(Cholestane)과 콜레스테롤이 각각 11～13분 및 16～18분에 용출되도록 유속 및 오븐온도를 조정한다.

사. 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 한다.

아. 정량시험

정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피크면적법에 따라 정량한다.

검체 중 콜레스테롤(mg/g) = C ××

C : 검량선에서 구한 시험용액의 농도(mg/mL)

W : 검체량(g)

V1: 추출에 사용한 헥산의 양(100 mL)

V2:농축에 사용된 헥산 추출액의 양(25 mL)

V3:유도체화 전 잔사(residue)를 녹이는 데 사용한 DMF의 양(3 mL)