2.2.2.16 비타민B군 동시분석법

가. 시험법 적용범위

영아용 조제식 및 성장기용 조제식, 조제유류 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중의 수용성 비타민B군 5종(B1, B2, B6, 니코틴아미드, 엽산)을 헥산설폰산나트륨이 함유된초산용액으로 추출 정제하여 역상칼럼으로 분리한 후 고속액체크로마토그래프 /자외부흡광검출기를 이용하여 정량하는 방법이다.

다. 장치 및 기구

1) 장치

고속액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(HPLC/UV)기구

가)원심분리기

나) 진탕기

다) 용매여과장치

라) 원심분리관

마) 분석저울 : 0.1 mg까지 측정이 가능한 것

라. 시약 및 시액

1) 메탄올 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 초산, 수산화나트륨, 헥산설폰산나트륨 : 특급시약 또는 이와 동등한 것

3) 증류수 : 3차 증류수로 18 MΩ 이상인 것

4) 이동상

가) 5 mM 헥산설폰산나트륨이 함유된 0.1% 초산용액 : 초산 1 mL을 1 L 용량플라스크에 넣은 후 증류수로 약 900 mL까지 채우고, 헥산 설폰산나트륨을 5 mM 농도가 되도록 넣고 혼합한 후 증류수로 1 L를 맞춘다.

나) 5 mM 헥산설폰산나트륨이 함유된 메탄올 : 메탄올을 약 900 mL까지 채우고, 헥산설폰산나트륨을 5 mM 농도가 되도록 넣고 혼합한 후 메탄올로 1 L를 맞춘다.

마. 표준용액 조제

1) 표준원액

가) 비타민B1, 비타민B6, 니코틴아미드:비타민B10.01 g, 비타민 B60.01 g, 니코틴아미드 0.1 g을 100 mL 용량플라스크에 넣고 이동상 가)의 용액으로 용해하면서 용량을 맞춘다.

나) 비타민B2, 엽산 : 비타민B20.01 g, 엽산 0.01 g을 100 mL 용량플라스크에 넣고 0.1 N 수산화나트륨용액으로 용량을 맞춘다.

2) 표준용액: 비타민B1,B2,B6,엽산 표준원액은 1 mL, 니코틴아미드의 표준원액은 1 mL을 취하여 100 mL 용량플라스크에 넣고 이동상 가)의 용액으로 용량을 맞추어 각각 1 ㎍/mL 및 10 ㎍/mL이 되도록 조제한다.

3) 검량곡선표준용액 : 비타민B1,B2,B6,엽산 표준용액은 이동상 가)로 희석하여 0.05, 0.10, 0.25, 0.5 및 1 ㎍/mL이 되도록 조제한고, 니코틴아미드 표준용액은 이동상 가)로 희석하여 0.5, 1, 2.5, 5 및 10 ㎍/mL이 되도록 조제한다.

바. 시험용액 조제

시료 약 1 g을 정밀히 달아 원심분리관에 넣고 5 mM 헥산설폰산나트륨이 함유된 0.1% 초산용액을 20 mL를 넣어 녹인다. 15분간 진탕기로 잘 섞은 후, 이어서 15분간 초음파 추출하고 15,000 rpm, -10℃에서 10분간 원심 분리한다. 상층액의 일부를 0.2 µm 나일론 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

사. 시험방법

1) 고속액체크로마토그래프 조건

- 분석칼럼 : C18(4.6×250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

- 칼럼온도 : 30℃

- 유속 : 0.6 mL/min

- 검출파장 : UV 270 nm

- 주입량 : 50 μL

- 이동상 : 5 mM 헥산설폰산나트륨이 함유된 0.1 % 초산용액(A)

5 mM 헥산설폰산나트륨이 함유된 메탄올(B)

시간(분)	A(%)	B(%)
0	80	20
8.0	80	20
16.0	40	60
18.0	20	80
18.1	0	100
30.0	0	100
30.1	80	20
35	80	20

2) 정량시험

표준용액과 시험용액을 각각 주입하여 피크의 머무름 시간을 비교하고 동일 물질인지 정성 확인 후 표준용액의 피크면적 또는 높이에 의해 구한 검량선을 사용하여 시험용액 중의 비타민 B군의 농도(㎍/mL)를 구하고, 검사시료 중 비타민 B군의 함량(㎍/100 g)을 산출한다.

비타민 B군 개별 함량 (㎍/100 g) = C × V/S × 100

C : 검량선에서 구한 비타민 B군의 개별 농도(㎍/mL)

V : 시험용액의 최종부피(mL)

S : 시료 채취량(g)

100 : 단위환산

＊ 부적합 시 개별 정량법으로 확인검사를 실시한다.