2.2.2.17 비타민 A 및 비타민 E 동시분석법

가. 액체크로마토그래프에 의한 정량

1) 시험법 적용범위

특수영양식품, 특수의료용도식품, 시리얼류에 적용한다.

2) 분석원리

특수영양식품, 특수의료용도식품은 염기 가수분해 후, 시리얼류는 산·염기 가수분해 후 석유에테르로 추출하고 고속액체크로마토그래프/자외선흡광검출기를 이용하여 정량하는 방법이다.

3) 장치 및 기구

가) 고속액체크로마토그래프 : 자외선흡광검출기(UV)

나) 기구

(1) 환류냉각장치

(2) 감압농축기

(3) 용매여과장치

(4) 초자기구 : 갈색 둥근바닥플라스크, 갈색 분액깔때기, 마개있는 갈색 시험관

4) 시약 및 시액

가) 에탄올, 메탄올, 석유에테르, 물 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 피로갈롤, 수산화칼륨, 페놀프탈레인, 무수황산나트륨 : 특급시약 또는 이와 동등한 것

다) 10% 피로갈롤·에탄올 용액 : 피로갈롤 10 g을 에탄올에 녹여 100 mL가 되게 한다.

라) 90% 수산화칼륨용액 : 수산화칼륨 90 g을 물에 녹여 100 mL가 되게 한다.

마) 페놀프탈레인 시액 : 페놀프탈레인 1 g을 에탄올에 녹여 100 mL가 되게 한다.

바) 2N 염산

5) 표준용액의 조제

가) 비타민 A(레티놀)를 에탄올로 희석하여 2.5, 5, 10, 25, 50 mg/L의 농도가 되도록 제조한다. 사용 시 제조하고 차광하여 사용한다.

나) 비타민 E 동족체(α-, β-, γ-, δ-토코페롤)를 각각 에탄올로 희석하여 2.5, 5, 10, 25, 50 mg/L의 농도가 되도록 제조한다. 사용 시 제조하고 차광하여 사용한다.

6) 시험용액의 조제

가) 특수영양식품, 특수의료용도식품

비타민 A 20∼30 IU(6∼9 µg), 비타민 E 0.2 mg에 해당하는 시료를 정밀히 달아 갈색 둥근바닥플라스크에 넣어 에탄올 30 mL 및 10% 피로갈롤·에탄올 용액 1 mL를 가하고 이에 90% 수산화칼륨 용액 3 mL를 가해 충분히 혼합한다. 플라스크에 환류냉각기를 부착하고 95℃ 수욕에 플라스크를 2/3 잠기게 하여 30분 동안 비누화한다. 비누화 후 즉시 냉각하여 실온으로 하고 물 30 mL를 가해 갈색 분액깔때기에 옮긴다. 플라스크를 물 10 mL로 씻고 이어서 석유에테르 30 mL로 씻은 후 갈색 분액깔때기에 합한다. 분액깔때기를 잘 흔들어 혼합하여 방치한 후 물층을 다른 갈색 분액깔때기에 옮긴다. 옮긴 물층에 석유에테르 30 mL를 가하여 추출하는 과정을 2회 반복하고, 석유에테르층을 첫번째 갈색 분액깔때기에 있는 석유에테르층에 합하여 물 10 mL로 1회, 이어 물 50 mL로 반복하여 씻는다(수세액이 페놀프탈레인 시액으로 분홍색이 되지 않을 때까지 행한다). 물층과 충분히 분리한 석유에테르층을 무수황산나트륨에 통과시킨 것을 갈색 둥근바닥플라스크에 받는다. 무수황산나트륨에 석유에테르 10 mL를 가하여 씻는 과정을 2회 반복하고, 씻은 액을 석유에테르층이 담겨있는 플라스크에 모두 합한다. 석유에테르층이 담긴 플라스크를 40∼45℃에서 감압증발건조한 후 잔류물에 에탄올 일정량을 가하여 녹인 액을 0.45 µm 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

나) 시리얼류

비타민 A 20∼30 IU(6∼9 µg), 비타민 E 0.2 mg에 해당하는 시료를 정밀히 달아 마개있는 갈색 시험관에 넣는다. 10% 피로갈롤·에탄올 용액 1 mL, 물 30 mL, 2N 염산 1 mL를 가해 섞은 후 뚜껑을 닫아 70℃ 항온수조에서 30분 동안 가수분해하면서 때때로 흔들어준다. 가수분해 후 즉시 냉각하여 실온으로 하고 갈색 둥근바닥플라스크로 옮겨 에탄올 30 mL로 시험관을 씻어 플라스크에 넣는다. 이에 90% 수산화칼륨 용액 3 mL를 벽면을 통해 천천히 가해 충분히 혼합한 다음, 환류냉각기를 부착하고 95℃ 수욕에 플라스크를 2/3 잠기게 하여 30분 동안 비누화한다. 비누화 후 즉시 냉각하여 실온으로 하고 물 30 mL를 가해 갈색 분액깔때기에 옮긴다. 플라스크를 물 10 mL로 씻고 이어서 석유에테르 30 mL로 씻은 후 갈색 분액깔때기에 합한다. 분액깔때기를 잘 흔들어 혼합하여 방치한 후 물층을 다른 갈색 분액깔때기에 옮긴다. 옮긴 물층에 석유에테르 30 mL를 가하여 추출하는 과정을 2회 반복하고, 석유에테르층을 첫번째 갈색 분액깔때기에 있는 석유에테르층에 합하여 물 10 mL로 1회, 이어 물 50 mL로 반복하여 씻는다(수세액이 페놀프탈레인 시액으로 분홍색이 되지 않을 때까지 행한다). 물층과 충분히 분리한 석유에테르층을 무수황산나트륨에 통과시킨 것을 갈색 둥근바닥플라스크에 받는다. 무수황산나트륨에 석유에테르 10 mL를 가하여 씻는 과정을 2회 반복하고, 씻은 액을 석유에테르층이 담겨있는 플라스크에 모두 합한다. 석유에테르층이 담긴 플라스크를 40∼45℃에서 감압증발건조한 후 잔류물에 에탄올 일정량을 가하여 녹인 액을 0.45 µm 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

7) 시험방법

가) 고속액체크로마토그래프 조건

(1) 컬럼 :Develosil RP-Aqueous C30 column(4.6 × 250 mm, 5 µm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상 : 메탄올 : 물(95:5, v/v)

(3) 컬럼온도 : 30 ℃

(4) 유속 : 1.2 mL/min

(5) 검출파장 : 비타민 A(레티놀) - UV 325 nm, 비타민 E(α-, β-, γ-, δ-토코페롤) - UV 298 nm

(6) 주입량 : 20 µL

나) 정량시험

표준용액과 시험용액을 각각 주입하고 피크의 머무름 시간을 비교하여 동일 물질인지 정성 확인 후 표준용액의 피크면적 또는 높이에 의해 구한 검량선을 사용하여 시험용액 중의 비타민 A와 비타민 E의 농도(mg/L)를 구하고, 시료 중 비타민 A와 비타민 E의 개별 함량을 산출한다.

비타민 함량(mg/100g) = C ××

C : 시험용액 중 비타민의 농도(mg/L)

V : 시험용액의 최종 부피(mL)

S : 시료의 채취량(g)

D : 희석배수

: 단위 환산