4.26식중독균에 대한 분자생물학적 시험법

가. 살모넬라 시험법

1) 주형유전자 준비

증균 배양액(1～2 mL)을 취한 후, 10분간 끓여 원심분리하고, 상등액 10～20 μL를 취하여 시료로 사용한다.

※ 상기의 방법과 동등 이상인 유전자추출키트 및 장비를 사용할 수 있다.

2) Real-time PCR 프라이머 및 프로브 염기서열

유전자	프라이머/프로브	염기서열(5‘→3’)
invA	invA-F invA-R invA-P	5‘-GAA TCC TCA GTT TTT CAA CGT TTC-3’ 5‘-CGA ATT GCC CGA ACG TGG CGA-3’ 5‘-FAM -CTC TTT CGT CTG GCA TTA TCG ATC AGT ACC AG - BHQ1-3’

3) Real-time PCR 반응액 조제

성분	최종농도	Stock용액 농도	1회 용량
Master Mix1)	1×	2×	10μL
invA 프라이머(F)	0.5 pmol/μL	10 pmol/μL	1μL
invA 프라이머(R)	0.5 pmol/μL	10 pmol/μL	1μL
invA 프로브(P)	0.1 pmol/μL	2 pmol/μL	1μL
주형 DNA	-	-	5μL
증류수	-	-	2 μL
총량	-	-	20μL

1)PowerAmp
TMReal-time PCR Master Mix와 동등 이상의 시약을 사용할 수 있다.

4) Real-time PCR 반응조건

PCR 반응조건은 50℃에서 2분간 유지 및 95℃에서 10분간 방치하여 최초 변성이 일어나게 한 후, 95℃에서 15초간 변성시키고, 60℃에서 1분간유전자 결합 및 신장반응이 일어나는것을 1회로 하여 총 40회의 증폭반응을 한다.

구분	온도	시간	반응회수
	50℃	2분	1회
초기변성(Initial denaturation)	95℃	10분	1회
변성(denaturation)	95℃	15초	40회
결합(annealing)/ 신장(extension)	60℃	1분

* 상기 PCR 조건이 최적이 아닌 경우 변형하여 사용할 수 있다.

5) 결과 확인

(1) PCR 반응에서 증폭곡선이 확인되지 않는 경우 살모넬라 불검출로 판정할 수 있다. 다만, 음성대조군에서 증폭곡선이 확인되거나 양성대조군에서 증폭곡선이 확인되지 않을 경우 재시험하여야 한다.

(2) 증폭곡선이 확인되는 경우 분리배양 후 생화학적 검사 등을 통하여 살모넬라로 동정되면 검출로 판정한다.

나. 크로노박터 시험법

1) 주형유전자 준비

증균 배양액(1∼2 mL)을 취한 후,유전자 추출키트 및 장비 등을 사용하여 유전자를 추출한다.

2) Real-time PCR 프라이머 및 프로브 염기서열

프라이머/프로브	염기서열(5‘→3’)
Forward	5‘-GGG ATA TTG TCC CCT GAA ACA G-3’
Reverse	5‘-CGA GAA TAA GCC GCG CAT T-3’
Probe	5‘-FAM-AGA GTA GTA GTT GTA GAG GCC GTG CTT CCG AAA G-TAMRA-3’

3) Real-time PCR 반응액 조제

성분	최종농도	Stock용액 농도	1회 용량
Universal Master Mix	1×	2×	12.5μL
프라이머(F)	900nM	10 pmol/μL	2.25μL
프라이머(R)	900nM	10 pmol/μL	2.25μL
프로브(P)	250nM	10 pmol/μL	0.625μL
주형 DNA	-	-	5μL
총량	-	-	25μL

4) Real-time PCR 반응조건

구분	온도	시간	반응회수
초기변성(Initial denaturation)	95℃	3분	-
변성(denaturation)	95℃	15초	40회
결합(annealing)	52℃	20초
신장(extension)	72℃	30초

※상기 PCR 조건이 최적이 아닌경우 변형하여 사용할 수 있다.

5) 결과 확인

PCR 반응에서 증폭곡선이 확인되는 경우 크로노박터가 검출된것으로 판정한다. 다만, 음성대조군에서 증폭곡선이 확인되거나양성대조군에서 증폭곡선이 확인되지 않을 경우 재시험하여야 한다.

다. 장염비브리오 시험법

1) 주형 유전자 준비

증균 배양액(1∼2 mL)을 취한 후, 유전자 추출키트 및 장비 등을 사용하여 유전자를 추출한다.

2) Real-time PCR 프라이머 염기서열

Target gene	염기서열(5‘→3’)
toxR	Foward	GAA CCA GAA GCG CCA GTA GT
	Reverse	AAA CAG CAG TAC GCA AAT CG
	Probe	FAM-TCA CAG CAG AAG CCA CAG GTG C-TAMRA

3) Real-time PCR 반응액 조제

성분	최종농도	Stock용액 농도	1회 용량
Master Mix	1x	2x	12.5 μL
toxR프라이머(F)	100 nM	10 pmol/μL	0.25 μL
toxR프라이머(R)	100 nM	10 pmol/μL	0.25 μL
toxR프로브(P)	500 nM	10 pmol/μL	1.25 μL
주형 DNA	-	-	5 μL
증류수	-	-	5.75 μL
총량	-	-	25 μL

4) Real-time PCR 반응조건

구분	온도	시간	반응회수
초기변성(Initial denaturation)	95℃	10분	-
변성(Denaturation)	95℃	15초	45
결합(Annealing)	60℃	1분

※ 상기 Real-time PCR 반응액 조성 및 조건이 최적이 아닌 경우 변형하여 사용할 수 있다.

5) 결과 확인

(1) PCR 반응에서 증폭곡선이 확인되지 않는 경우 장염비브리오 불검출 로 판정할 수 있다. 다만, 음성대조군에서 증폭곡선이 확인되거나 양성대조군에서 증폭곡선이 확인되지 않을 경우 재시험하여야 한다.

(2) 증폭곡선이 확인되는 경우 분리배양 후 생화학적 검사 등을 통하여 장염비브리오로 동정되면 검출로 판정한다.

라. 리스테리아 모노사이토제네스 시험법

1) 주형 유전자 준비

증균 배양액(1～2 mL)을 취한 후, 유전자 추출키트 및 장비 등을 사용하여 유전자를 추출한다.

2) Real-time PCR 프라이머 염기서열

Target gene	염기서열(5‘→3’)
iap	Foward	CTA AAG CGG GAA TCT CCC TT
	Reverse	CCA TTG TCT TGC GCG TTA AT
	Probe	FAM-CCT CTG GCG CAC AAT ACG CTA GCA CT- TAMRA

3) Real-time PCR 반응액 조제

성분	최종농도	Stock용액 농도	1회 용량
Master Mix	1×	2×	12.5μL
iap프라이머(F)	300 nM	10 pmole/μL	2.5 μL
iap프라이머(R)	300 nM	10 pmole/μL	2.5 μL
iap프로브(P)	300 nM	10 pmole/μL	2.5μL
주형 DNA	-	-	5μL
총량	-	-	25μL

4) Real-time PCR 반응조건

구분	온도	시간	반응회수
초기변성(Initial denaturation)	50℃	2분	-
	95℃	10뷴	-
변성(Denaturation)	95℃	15초	40
결합(Annealing)	60℃	1분

※ 상기 Real-time PCR 반응액 조성 및 조건이 최적이 아닌 경우 변형하여 사용할 수 있다.

5) 결과 확인

(1) PCR 반응에서 증폭곡선이 확인되지 않는 경우 리스테리아 모노사이토제네스 불검출로 판정할 수 있다. 다만, 음성대조군에서 증폭곡선이 확인되거나 양성대조군에서 증폭곡선이 확인되지 않을 경우 재시험하여야 한다.

(2) 증폭곡선이 확인되는 경우 분리배양 후 생화학적 검사 등을 통하여 리스테리아 모노사이토제네스로 동정되면 검출로 판정한다.

마. 캠필로박터 제주니/콜리 시험법

1) 주형 유전자 준비

증균배양액(1-2 mL)을 취한후, 유전자 추출키트 및 장비 등을 사용하여 유전자를 추출한다.

2) Real-time PCR 프라이머 염기서열

Target gene	프라이머/프로브	염기서열(5‘→3’)	size (bp)
mapA (캠필로박터 제주니)	Forward	CTG GTG GTT TTG AAG CAA AGA TT	-
	Reverse	CAA TAC CAG TGT CTA AAG TGC GTT TAT
	Probe	FAM-TTG AAT TCC AAC ATC GCT AAT GTA TAA AAG CCC TTT - TAMRA
ceuE (캠필로박터 콜리)	Forward	AAG CTC TTA TTG TTC TAA CCA ATT CTA ACA	-
	Reverse	TCA TCC ACA GCA TTG ATT CCT AA
	Probe	VIC-TTG GAC CTC AAT CTC GCT TTG GAA TCA TT-TAMRA

3) Real-time PCR 반응액 조제

성분	최종농도	Stock용액 농도	1회 용량
Taqman Universal Master Mix	1×	2×	12.5μL
프라이머(F)	300 nM	10 pmole/μL	0.75 μL
프라이머(R)	300 nM	10 pmole/μL	0.75 μL
프로브(P)	250 nM	10 pmole/μL	0.625μL
주형 DNA	-	-	5μL
증류수			5.375 μL
총량	-	-	25μL

4) Real-time PCR 반응조건

구분	온도	시간	반응회수
초기변성(initial denaturation)	50℃	2분	-
	95℃	10분	-
변성(denaturation)	95℃	15초	40
결합(annealing)	60℃	1분

※ 상기 Real-time PCR 반응액 조성 및 조건은 적절하게 변형하여 사용할 수 있다.

5) 결과 확인

(1) PCR 반응에서 증폭곡선이 확인되지 않는 경우 캠필로박터 제주니/콜리 불검출로 판정할 수 있다. 다만, 음성대조군에서 증폭곡선이 확인되거나 양성대조군에서 증폭곡선이 확인되지 않을 경우 재시험하여야 한다.

(2) 증폭곡선이 확인되는 경우 분리배양 후 생화학적 검사 등을 통하여 캠필로박터 제주니/콜리로 동정되면 검출로 판정한다.