6.2.1 올리고당

가. 프락토올리고당

1) 장치

액체크로마토그래프-시차굴절검출기(Refractive Index detector, RI)

2) 시약 및 시액

가) 표준당

1-케스토즈(GF2)

니스토즈(GF3)

1-F 프락토퓨라노실니스토즈(GF4)

나) 물: HPLC용

다) 에탄올: HPLC용

라) 아세토니트릴: HPLC용

3) 표준용액의 조제

각 표준당을 물로 녹여 20 mg/mL 농도가 되도록 조제한 후 혼합하여 표준원액으로 한다. 표준원액을 물로 희석하여 312.5∼5,000 μg/mL 범위로 조제하여 표준용액으로 한다.

4) 시험용액의 조제

프락토올리고당으로서 0.2∼2 g이 되도록 검체를 취해 물 20 mL에 용해한 후 100 mL로 정용한다(필요시 1,000 × g에서 10분간 원심분리한다).상등액 25 mL를 취하여 50 mL 메스플라스크에 옮겨 넣고 에탄올로 정용한다.이 용액을 0.45μm의 필터로 여과하여 시험용액으로 사용한다.

5) 시험방법

가) 액체크로마토그래프 조건

(1)칼럼: Asahipak NH
2P-50 4E(4.6 mm i.d. × 250 mm × 5 μm) 혹은 이와 동등한 것

(2) 온도: 40℃

(3) 이동상: 65% 아세토니트릴

(칼럼의 종류나 상태에 따라 조성을 달리 할 수 있다. 아세토니트릴과 물의 비율을 65∶35 에서 70∶30정도의 차이로 조정한다.)

(4) 유속: 1.0 mL/min

(5) 검출기: 시차굴절검출기(RI)

6) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램 상의 피크는 어느 측정조건에서도 시험용액과 표준용액 피크의 머무름 시간이 일치하여야 한다.

7) 정량시험

표준용액과 시험용액을 각각 10μL씩 주입하여 위의 조건에서 시험한다. 표준용액의 피크 면적 또는 높이에 의해 구한 검량선을 사용하여 프락토올리고당의 농도(mg/mL)를 구하고, 다음 식에 의해 프락토올리고당 함량(%)을 계산한다.

프락토올리고당 함량(%) =		(A+B+C)		× a × b ×	100
		시료채취량(g)			1,000

A: 시험용액 중의 GF2의 농도(mg/mL)

B: 시험용액 중의 GF3의 농도(mg/mL)

C: 시험용액 중의 GF4의 농도(mg/mL)

a: 시험용액의 전량(mL)

b: 시험용액의 희석배수

나. 이소말토올리고당

1) 장치

액체크로마토그래프-시차굴절검출기(Refractive Index detector, RI)

2) 시약 및 시액

가) 표준당

단당류—Glucose

이당류—Maltose

삼당류—Maltotriose

사당류—Maltotetraose

오당류—Maltopentaose

육당류—Maltohexaose

칠당류—Maltoheptaose

나) 물: HPLC용

다) 50% 에탄올

라) 아세토니트릴: HPLC용

3) 표준용액의 조제

각 표준당을 물로 녹여 100 mg/mL 농도가 되도록 조제한 후 혼합하여 표준원액으로 한다. 표준원액을 물로 희석하여 625∼10,000 μg/mL 범위로 조제하여 표준용액으로 한다.

4) 시험용액의 조제

이소말토올리고당으로서 약 0.1∼0.5 g이 되도록 검체를 취해 물 또는 50% 에탄올(단백질을 함유한 경우) 15 mL에 용해한 후 50 mL로 정용한다(필요시1,000 × g에서 10 분간 원심분리 한다).이 용액을 0.45 μm의 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

5) 시험방법

가) 액체크로마토그래프 조건

(1) 배제형 이온교환계

① 칼럼: Asahipak NH2P-50 4E(4.6 mm i.d×250 mm×5 μm)혹은 이와 동등한 것

② 칼럼온도: 30℃

③ 이동상: 65% 아세토니트릴

④ 유속: 1.0 mL/min

⑤ 검출기:시차굴절검출기(RI)

(2) 역상분배계

① 칼럼: RSpak DC-613(6.0 mm i.d×150 mm×6 μm) 혹은 이와 동등한 것

② 칼럼온도: 50℃

③ 이동상: 70% 아세토니트릴

④ 유속: 0.8 mL/min

⑤ 검출기:시차굴절검출기(RI)

6) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램 상의 피크는 어느 측정조건에서도 시험용액과 표준용액 피크의 머무름 시간이 일치하여야 한다.

7) 정량시험

표준용액과 시험용액을 각각 10 μL씩 주입하여 위의 조건에서 시험한다. 표준용액의 피크 면적 또는 높이를 구하여 검량선을 작성한다.

가) 배제형 이온교환계에서 분석한 피크면적 또는 높이에 의해 각 중합도의 함유량(mg/mL)이 구해지며 그 결과는 다음과 같다.

DP1(단당류): A

DP2(이당류): B

DP3(삼당류): C

DP4(사당류): D

DP5(오당류): E

DP6(육당류): F

DP7(칠당류): G

나) 역상분배계에서 시료를 분석한 Data의 각 당분함유율(%)은 다음과 같다.

DP1 GlucoseA1

DP1 Glucose 이외의 단당류 A2

DP2 MaltoseB1

DP2 Maltose 이외의 이당류 B2

DP3 MaltotrioseC1

DP3 Maltotriose 이외의 삼당류 C2

DP4 Maltotetraose D1

DP4 Maltotetraose 이외의 사당류 D2

DP5 Maltopentaose E1

DP5 Maltopentaose 이외의 오당류 E2

DP6 MaltohexaoseF1

DP6 Maltohexaose 이외의 육당류F2

DP7 Maltoheptaose G1

DP7 Maltoheptaose 이외의 칠당류 G2

DP1 Glucose(mg/mL) A ×＝ a

DP2 Maltose(mg/mL)B ×＝ b

DP3 Maltotriose(mg/mL) C ×＝ c

DP4 Maltotetraose(mg/mL) D ×＝ d

DP5 Maltopentaose(mg/mL) E ×＝ e

DP6 Maltohexaose(mg/mL) F ×＝ f

DP7 Maltoheptaose(mg/mL) G ×＝ g

이소말토올리고당 함량(%)		=	T-(a+b+c+d+e+f+g)		× h × i ×	100
			시료채취량(g)			1,000

T(배제형 이온교환계에서 분석한 당의 함유량) = A+B+C+D+E+F+G

h : 시험용액의 전량(mL)

i : 시험용액의 희석배수

다. 갈락토올리고당(전이갈락토올리고당)

1) 장치

액체크로마토그래프-시차굴절검출기(Refractive Index detector, RI)

2) 시약 및 시액

가) 표준당

Glucose

Galactose

Lactose

Galactooligosaccharides(순도 70% 이상)

나) 물: HPLC용

다) 20%(w/v) 설포살리실린산용액: 설포살리실산(Sulfosalicylic acid) 20 g에 물을 넣어 용해시켜 100 mL로 한다.

라) 아세토니트릴: HPLC용

3) 표준용액의 조제

Galactooligosaccharides(GOS) 4g을 물 20 mL로 녹여 50 mL로 정용한 후 혼합하여 표준원액으로 한다. 표준원액을 이동상으로 희석하여 8,000∼40,000 μg/mL 범위로 조제하여 표준용액으로 한다. 머무름시간 확인을 위해 glucose, galactose, lactose는 50 mg씩 10 mL의 이동상에 녹여(5,000 μg/mL) 표준용액으로 한다.

4) 시험용액 조제

갈락토올리고당으로서 0.1∼1 g이 되도록 검체를 취해 물 20 mL에 용해한 후 50 mL로 정용한다. 단, 단백질 제거 조작이 필요한 시료에 대해서는 20% 설포살리실산용액을여러 방울 첨가하여 생긴 불용성 단백질을1,000 × g에서 10분간 원심분리하여 제거한다.이 용액을 0.45μm의 필터로 여과하여 시험용액으로 사용한다.

5) 시험방법

가) 액체크로마토그래프 조건

(1) 배제형 이온교환계

① 칼럼: Shodex SC1011(8.0 mm i.d × 300 mm × 6 μm) 혹은 이와 동등한 것

② 칼럼온도: 80℃

③이동상: 물

④유속: 0.4 mL/min

⑤검출기: 시차굴절검출기(RI)

(2) 역상분배계

① 칼럼: TSK GEL NH2-100(4.6 mm i.d×150 mm×3μm) 혹은 이와 동등한 것

② 칼럼온도: 35℃

③ 이동상: 70% 아세토니트릴

④ 유속: 0.8 mL/min

⑤ 검출기: 시차굴절검출기(RI)

6) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램 상의 피크는 어느 측정조건에서도 시험용액과 표준용액 피크의 머무름 시간이 일치하여야 한다.

7) 정량시험

가) 배제형 이온교환계

표준용액과 시험용액을 각각 2 μL씩 주입하여 위의 조건에서 시험한다. 표준용액의 피크 면적 또는 높이를 구하여 각 당류의 함유량(mg/mL)이 구해지며 그 결과는 다음과 같다.

DP2(이당류): A

DP3(삼당류 이상): B

그림 1. 갈락토올리고당 크로마토그램(배제형 이온교환계)

나) 역상분배계

10,000 μg/mL 농도의 GOS 표준용액, 5,000 μg/mL 농도의 glucose, galactose, lactose표준용액과 시험용액을 각각 10 μL씩 주입하여 위의 조건에서시험하여 각 당류의비율(%)을 구한다(단, 용액의 농도는 필요에 따라 조절 가능하다). 전체 당 함량을 100으로 했을 때 각 중합도의 당류 비율은 다음과 같다.

DP1(전체 당 함량 중 단당류의 비율): a

DP2(전체 당 함량 중 이당류의 비율): b

DP3(전체 당 함량 중 삼당류 이상의 비율): c

(a + b + c = 100(%))

그림 2. 갈락토올리고당 크로마토그램(역상분배계)

갈락토올리고당함량(%)		=	[(A×d/b)+B]	× e × f ×	100
			시료채취량(g)		1,000

b: 전체 당 함량 중 이당류의 비율

d : 전체 당 함량 중 lactose를 제외한 이당류의 비율

e : 시험용액의 전량(mL)

f : 시험용액의 희석배수

라. 갈락토올리고당(라피노스, 스타치오스)

1) 장치

액체크로마토그래프-시차굴절검출기(Refractive Index detector, RI)

2) 시약 및 시액

가) 표준당

Raffinose

Stachyose

나) 물: HPLC용

다) 20%(w/v) 설포살리실린산용액: 설포살리실산(Sulfosalicylic acid) 20 g에 물을 넣어 용해시켜 100 mL로 한다.

라) 아세토니트릴: HPLC용

3) 표준용액의 조제

각 표준당을 물로 녹여 10 mg/mL 농도가 되도록 조제한 후 혼합하여 표준원액으로 한다. 표준원액을 물로 희석하여312.5∼5,000μg/mL 범위로 조제하여 표준용액으로 한다.

4) 시험용액 조제

각 갈락토올리고당으로서 0.01∼0.1 g이 되도록 검체를 취해 물 20 mL에 용해한 후 50 mL로 정용한다. 단,단백질 제거 조작이 필요한 시료에 대해서는 20% 설포살리실산용액을 여러 방울 첨가하여 생긴 불용성 단백질을 1,000 × g에서 10분간 원심분리하여 제거한다. 이 용액을 0.45 μm의 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

5) 시험방법

가) 액체크로마토그래프 조건

(1) 칼럼: Asahipak NH
2P-50 4E(4.6 mm i.d×250 mm×5 μm) 혹은 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도: 35℃

(3) 이동상: 65% 아세토니트릴

(4) 유속: 1.0 mL/min

(5) 검출기: 시차굴절검출기(RI)

6) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램 상의 피크는 어느 측정조건에서도 시험용액과 표준용액 피크의 머무름 시간이 일치하여야 한다.

7) 정량시험

표준용액과 시험용액을 각각 10 μL씩 주입하여 위의 조건에서 시험한다. 표준용액의 피크 면적 또는 높이에 의해 구한 검량선을 사용하여 갈락토올리고당의 비율(%)을 구하고, 다음 식에 의해 갈락토올리고당 함량(%)을 계산한다.

갈락토올리고당 함량(%)		=	A+B	× a × b ×	100
			시료채취량(g)		1,000

A: 시험용액 중의 라피노스의 농도(mg/mL)

B: 시험용액 중의 스타치오스의 농도(mg/mL)

a: 시험용액의 전량(mL)

b: 시험용액의 희석배수

마. 말토올리고당

1) 장치

액체크로마토그래프-시차굴절검출기(refractive index detector, RI)

2) 시약 및 시액

가) 67% 아세토니트릴(Acetonitrile)

나) 물: HPLC용

다) 표준당

삼당류(DP3)-Maltotriose

사당류(DP4)-Maltotetraose

오당류(DP5)-Maltopentaose

육당류(DP6)-Maltohexaose

칠당류(DP7)-Maltoheptaose

팔당류(DP8)-Maltooctaose

구당류(DP9)-Maltononaose

십당류(DP10)-Maltodecaose

3) 표준용액의 조제

각 중합도(중합도 3∼7은 500 mg씩, 중합도 8∼10은 50 mg씩)의 말토올리고당을 정확하게 달아 증류수 20 mL로 녹이고 이동상으로 50 mL로 정용하여 표준원액으로 한다. 중합도 3∼7은 625∼10,000 μg/mL, 중합도 8∼10은 62.5∼1,000 μg/mL가 되도록 이동상으로 용해하여 표준용액으로 사용한다.

4) 시험용액의 조제

시료 4 g을 달아 증류수 20 mL로 녹이고 이동상으로 100 mL 정용한다. 0.45 μm의 필터로 여과하여 시험용액으로 사용한다.

5) 시험방법

가) 고속액체크로마토그래프 조건

(1) 칼럼: Shodex HILICpak VN-50 4D 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도: 30℃

(3) 이동상: 67% 아세토니트릴

(4) 유속: 0.3 mL/min

(5) 검출기: 시차굴절계(RI)

6) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램 상의 피크는 어느 측정조건에서도 시험용액과 표준용액 피크의 머무름 시간이 일치하여야 한다.

7) 정량시험

표준용액과 시험용액을 각각 5 μL 씩 주입하여 얻은 표준용액 피크면적 또는 높이를 구하여 검량선을 작성한 후 시험용액의 말토올리고당 농도(μg/mL)를 구하고, 다음 식에 의해 검체 중 말토올리고당의 함량(%)을 계산한다. 다만, DP3 ∼ DP7의 함량이 40% 이상인 경우, DP8 ∼ DP10의 시험은 생략할 수 있다.

가) 계산방법

말토올리고당 함량(%) =˟ a ˟ b ˟

DP3 Maltotriose A(μg/mL)

DP4 Maltotetraose B(μg/mL)

DP5 Maltopentaose C(μg/mL)

DP6 Maltohexaose D(μg/mL)

DP7 Maltoheptaose E(μg/mL)

DP8 Maltooctaose F(μg/mL)

DP9 Maltononaose G(μg/mL)

DP10 Maltodecaose H(μg/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 시험용액의 희석배수

바. 자일로올리고당

1) 장치

액체크로마토그래프-시차굴절검출기(Refractive Index detector, RI)

2) 시약 및 시액

가) 표준당

이당류 - xylobiose

삼당류 - xylotriose

사당류 - xylotetraose

오당류 - xylopentaose

육당류–xylohexaose

나) 물: HPLC용

다) 아세토니트릴(Acetonitrile): HPLC용

3) 표준용액의 조제

각 표준당을 물로 녹여 100 mg/mL 농도가 되도록 조제한 후 혼합하여 표준원액으로 한다. 표준원액을 물로 희석하여 1∼5 mg/mL 범위로 조제하여 표준용액으로 한다.

4) 시험용액의 조제

자일로올리고당이 약 100 mg 되도록검체를 취해 물 20 mL에 용해한 후 50 mL로 정용한다. 이 용액을 0.45 μm의 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

5) 시험방법

가) 액체크로마토그래프 조건

(1) 칼럼: RSpak DC613 column
(6.0 mm i.d ×150 mm ×6 μm) 혹은 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도: 50℃

(3) 이동상: 67% 아세토니트릴(칼럼의 종류나 상태에 따라 조성을 달리 할 수 있다.)

(4) 유속: 0.8 mL/min

(5) 검출기: 시차굴절검출기(RI)

6) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램 상의 피크는 어느 측정조건에서도 시험용액과 표준용액 피크의 머무름 시간이 일치하여야 한다.

7) 정량시험

표준용액과 시험용액을 각각 5 μL씩 주입하여 위의 조건에서 시험한다. 표준용액의 피크 면적 또는 높이에 의해 구한 검량선을 사용하여 자일로올리고당의 농도(mg/mL)를 구하고, 다음 식에 의해 자일로올리고당 함량(%)을 계산한다.

A: 시험용액 중의 xylobiose의 농도(mg/mL)

B: 시험용액 중의 xylotriose의 농도(mg/mL)

C: 시험용액 중의 xylotetraose의 농도(mg/mL)

D: 시험용액 중의 xylopentaose의 농도(mg/mL)

E: 시험용액 중의 xylohexaose의 농도(mg/mL)

a: 시험용액의 전량(mL)

b: 시험용액의 희석배수

자일로올리고당 함량(%)		=	(A+B+C+D+E)	× a × b ×	100
			시료채취량(g)		1,000

사. 겐티오올리고당

1) 장치

액체크로마토그래프-시차굴절검출기(Refractive Index detector, RI)

2) 시약
및 시액

가)표준당

단당류(DP1): Glucose, Fructose

이당류(DP2): Gentiobiose, Cellobiose, Maltose

나)물: HPLC용

다)0.3 M Sodium hydroxide solution

라)0.5 M PMP 용액(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone, PMP): PMP시약 4.36 g을 메탄올에 녹여 50 mL가 되도록 한다.

마)0.3 M Hydrochloride solution

바)Chloroform

사) 0.01 M Potassium phosphate monobasic buffer: Potassium phosphate monobasic 2.7218 g을 물에 녹여 2L가 되도록 한다.

아) 0.01 M Potassium phosphate dibasic buffer: Potassium phosphate dibasic 3.4836 g을 물에 녹여 2L가 되도록 한다.

자)0.01M Potassium phosphate buffer(pH6.7): 사)용액에 아)용액을 첨가하여 pH 6.7로 조정한다.

차)아세토니트릴: HPLC용

카)Methanol

3)표준용액의 조제

가) 배제형 이온교환계

Glucose, fructose, maltose, gentiobiose, cellobiose를 각각 물로 녹여 50,000 μg/mL 농도가 되도록 조제한 후 혼합하여 표준원액으로 한다. 표준원액을 물로 희석하여 500∼4,000 μg/mL 범위로 조제하여 표준용액으로 한다.

나) 역상분배계

Glucose, maltose, gentiobiose, cellobiose를 각각 물로 녹여 1,000 μg/mL 농도가 되도록 조제한 후 혼합하여 표준원액으로 한다. 표준원액을 물로 희석하여 25∼200 μg/mL 범위로 조제하여 표준용액으로 한다.

4)시험용액의 조제

가) 배제형 이온교환계

겐티오올리고당으로서 약 100 mg이 되도록 검체를 취해 물 10 mL에 용해한 후 물을 사용하여 적당한 농도로 희석한다. 이 용액을 0.45μm의 필터로 여과하여 이를 시험용액으로 한다.

나) 역상분배계

겐티오올리고당으로서 약 10 mg이 되도록 검체를 취해 물 10 mL에 용해한다.시료 및 각 농도의 표준용액 100 μL를 각각 1.5 mL tube에 취하고 0.3 M NaOH 100 μL를 첨가한다. 0.5 M PMP 100 μL를 첨가하고 혼합하여 70℃ 수조에서 1시간 유도체화 후 냉각한다. 0.3 M HCl 100 μL를 첨가하여 중화한 후 CHCl31 mL를 넣고 20,000 × g에서 5분간 원심분리한다. 상층액을 취해 CHCl31 mL를 첨가하고 혼합하여 20,000 × g에서 5분간 원심분리한다(2회 반복). 상층액을 취해 0.45 μm의 필터로 여과하여 이를 시험용액으로 한다.

5)시험방법

가)배제형 이온교환계

(1)칼럼: Shodex KS801 Column
(8.0 mm i.d ×300 mm × 6 μm) 혹은 이와 동등한 것

(2)칼럼온도: 80℃

(3)이동상: 물

(4)유속: 0.8 mL/min

(5)검출기:시차굴절검출기(RI)

나)역상분배계

(1)칼럼: Shiseido UG120 C
18Column(4.6 mm i.d ×250 mm ×5μm)혹은 이와 동등한 것

(2)칼럼온도: 35℃

(3)이동상: A : B = 83 : 17

A:0.01M Potassium phosphate buffer(pH 6.7)

B: Acetonitrile

(4)유속: 0.8 mL/min

(5)검출기: PDA

6) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램 상의 피크는 어느 측정조건에서도 시험용액과 표준용액 피크의 머무름 시간이 일치하여야 한다.

7) 정량시험

표준용액과 시험용액을 각각 5 μL씩 주입하여 위의 조건에서 시험한다. 표준용액의 피크 면적 또는 높이를 구하여 검량선을 작성한다.

가)배제형 이온교환계에서 분석한 피크의 면적 또는 높이에 의해 각 중합도의 함유량(mg)이 구해지며 그 결과는 다음과 같다.

DP1(단당류):A

DP2(이당류):B

DP3 이상(3당류 이상): C

나) 역상분배계에서 시료를 분석한 Data의 각 당분함유율(%)은 다음과 같다.

DP1 FructoseA₁

DP1 GlucoseA₂

DP2 MaltoseB₁

DP2 GentiobioseB₂

DP2 CellobioseB₃

DP3 이상C

DP2 Gentiobiose B mg×= b₂mg

DP2 Cellobiose B mg×= b₃mg

겐티오올리고당 함량(%)		=	b2+ b3	× d × 100
			시료채취량(mg)

d: 시험용액의 희석배수