6.8.3.1 α-아밀라아제

가. 분석원리

검체 중 α-아밀라아제의 정량분석 값은 역가(Unit)로 나타내며, 1 역가(Unit)는시험용액조제 조건에서 1분간 전분으로부터 포도당1μg을 분해해내는데필요한 α-아밀라아제의양으로정의한다. 검량선을 통해산출된 시험용액 중 포도당의양을검체 1 g이함유하는 α-아밀라아제의 역가(Unit/g)로환산한다.

나. 장치

분광광도계(Spectrophotometer)

다. 시약

1) 1% 가용성 전분용액 : 가용성 전분(최순품) 1 g을 물에 녹이고 호화하여 100 mL로 한다.

2)맥바인(Mcllvaine) 완충액(pH 7.0) : 0.1 N 인산일수소나트륨액 일정량에 0.1 N 구연산액을 넣어 pH 7.0으로 한다.

3) 0.1% 염화칼슘용액∶염화칼슘(순품) 1 g을 물에 녹여 1 L로 한다.

4) DNS 용액 : 3,5-디니트로살리실산(dinitrosalicylic acid) 5.3 g과 수산화나트륨 9.9 g을 증류수 708 mL에 용해한 후 주석산칼륨나트륨(potassium sodium tartarate) 153 g, 페놀 3.8 mL, 메타중아황산나트륨(sodium metabisulfite) 4.15 g을 넣고 용해한 후 물을 이용하여 1L로 한 뒤 빛을 차단하여 보관한다.

5) 포도당용액 : 포도당(최순품)을 증류수에 녹여 2,000 μg/mL로 한다.

라. 시험용액의 조제

검체 5.0 g을 정밀히 달아 물 또는 맥바인 완충액에 녹여 100 mL로 한 다음 여과하여 검액으로 한다. 20 mL 시험관 2개를 준비하여 각각 시험용, 공시험용으로 한다. 시험용 시험관에 1% 가용성 전분용액 5 mL, 맥바인완충액(pH 7.0) 13 mL와 0.1% 염화칼슘용액 1 mL를 넣고 37℃로 가온하고 검액 1 mL를 넣은 후 37℃에서 20분간 방치 후, 100℃에서 10분간 가열하고 실온에서 냉각한 뒤 4℃, 10,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 사용한다.이와는별도로100℃에서 10분간 가열하여 활성을잃은 검액 1 mL를 위와 같이가용성 전분용액, 맥바인완충액,염화칼슘용액에 넣고 조작하여 공시험용으로 한다. 시험용과 공시험용 반응액 0.4 mL에 DNS 용액 1.2 mL을 넣은 후,100℃에서 5분간 가열하여 실온에서 냉각한 것을 시험용액 및 공시험용액으로 한다.

마. 검량선 작성

검량선 작성을 위해포도당용액을 증류수로 희석하여 10 μg/mL ∼ 1,000 μg/mL의농도로 한다. 희석된포도당용액들과 증류수 0.4 mL에 각각 DNS 용액 1.2 mL를 가한다.100℃에서 5분간 가열하여 실온에서 냉각한 것을 검량선 작성을위한 시험용액으로 하여 바. 시험조작에 따라 흡광도를 측정한다. 검량선은 농도별 포도당 표준용액의 흡광도 값에 증류수 표준용액 흡광도 값을 빼준 수치를 이용하여 작성한다.

바. 시험조작

물을 대조액으로 하여 액층 1 cm, 파장 540 nm에서 흡광도를 측정한다. 이때 시험용액의 흡광도는 공시험용액의 흡광도보다 커야 한다. 발색의 정도가 지나쳐 측정이 곤란한 경우는 검액을 희석하여 시험하고 희석배수를 적용한다. 시험용액중 효소반응에 의해 생성된포도당의 양은 시험용액의 흡광도 값에 공시험용액 흡광도 값을 뺀 수치를검량선에 대입하여 산출한다.

사. 효소의 역가 계산

검량선을 통해 산출된 시험용액 중 포도당의 양을 아래 식과 같이 검체 1 g이 함유하는 α-아밀라아제의 역가(Unit/g)로 환산하여 계산한다.

역가(Unit/g) =	시험용액 중 포도당 양(μg/0.4 mL) ✕ 100(100 mL 중 1 mL 효소반응) ✕ 50(20 mL 중 0.4 mL 발색 반응) ✕ 시험용액 희석배수
	20(효소반응 시간, 분) ✕ 5(검체 무게, g)