6.8.3.2 프로테아제

가. 분석원리

검체 중 프로테아제의 정량분석값은 역가(Unit)로 나타내며, 1역가(Unit)는 시험용액조제 조건에서1분간 카제인으로부터 L-티로신1μg을 분해해내는데필요한프로테아제의 양으로 정의한다.검량선을 통해 산출된 시험용액중 L-티로신의양을검체 1 g이 함유하는프로테아제의 역가(Unit/g)로 환산한다.

나. 장치

분광광도계(Spectrophotometer)

다. 시약

1) 0.6% 카제인용액∶카제인(최순품)을 건조하여 0.6 g을 달아 0.1 N 수산화나트륨액 20 mL에 가열하여 녹여서 식힌 다음 0.1 M 인산을 넣어 pH 7.0으로 조정하고, pH 7.0 완충액 20 mL를 넣어 100 mL로 한다.

2) 0.4 M 삼염화초산액∶삼염화초산(순품) 65.4 g을 물에 녹여 1 L로 한다.

3) 0.4 M 탄산나트륨액∶탄산나트륨(순품) 42.5 g을 물에 녹여 1 L로 한다.

4) 포린시액∶식품첨가물공전에 따라 만들어 원액으로 한다.

5) 완충액∶0.1 M 인산염완충액(pH 6.0 또는 8.0) 또는 0.1 M 초산염 완충액(pH 6.0 또는 8.0)

6) L-티로신용액 : L-티로신(tyrosine)을 2N HCl 용액에 녹여 2,000 μg/mL로 한다.

라. 시험용액의 조제

검체 약 5.0 g을 정밀히 달아 물 또는 완충액에 녹여 100 mL로 한 다음 여과하여 검액으로 한다. 0.6% 카제인용액 1 mL를 시험관에 넣고 37℃의 항온수욕중에서 가온한 다음 여기에 검액 1 mL를 정확히 넣고 잘 흔들어 섞는다. 곧 37℃의 항온수욕중에 넣고 정확히 10분간 반응시킨 다음 여기에 0.4 M 삼염화초산액 2 mL를 넣고 다시 37℃에서 25분간 방치한 다음 이것을 여과한다. 여액 1 mL를 시험관에 정확히 취하여 0.4 M 탄산나트륨용액 5 mL 및 포린시액(원액을 3배 희석한 액) 1 mL를 넣어 잘 흔들어 섞는다. 37℃에서 20분간 방치한 다음 발색된 액을 시험용액으로 한다. 이와는 별도로 검액 1 mL를 정확히 취하여 시험관에 넣고 37℃에서 10분간 방치한 후 0.4 M 삼염화초산액 2 mL를 넣어서 혼화하고 0.6% 카제인용액 1 mL를 넣어 37℃에서 25분간 방치한 다음 이하 시험용액과 동일하게 조작하여 공시험용액으로 한다.

마. 검량선 작성

검량선 작성을 위해L-티로신용액을2 N HCl 용액으로 희석하여10 μg/mL ∼ 1,000 μg/mL농도로 한다. 희석된 L-티로신용액들과 2 N HCl 용액1 mL를 각각시험관에 정확히 취하여 0.4 M탄산나트륨용액 5 mL 및 포린시액(원액을 3배 희석한 액) 1 mL를 넣어 잘 흔들어 섞는다. 37℃에서 20분간 방치한 다음발색된 액을검량선 작성을위한 시험용액으로 하여 바. 시험조작에 따라 흡광도를 측정한다.검량선은 농도별 L-티로신용액의 흡광도 값에2 N HCl용액 흡광도 값을 빼준 수치를 이용하여 작성한다.

바. 시험조작

물을 대조액으로 하여 액층 1 cm, 파장 660 nm에서 흡광도를 측정한다. 이때 시험용액의 흡광도는 공시험의 흡광도보다 커야 한다. 발색의 정도가 지나쳐 측정이 곤란한 경우는 검액을 희석하여 시험하고 희석배수를 적용한다. 시험용액 중 효소반응에 의해 생성된 L-티로신의 양은 시험용액의 흡광도 값에 공시험용액의 흡광도 값을 뺀 수치를검량선에 대입하여 산출한다.

사. 효소의 역가 계산

검량선을 통해 산출된 시험용액 중 L-티로신의 양을 아래 식과 같이 검체 1 g이 함유하는 프로테아제의 역가(Unit/g)로 환산하여 계산한다.

역가(Unit/g) =	시험용액 중 L-티로신 양(μg/mL) ✕ 100(100 mL 중 1 mL 효소반응) ✕ 4(4 mL 중 1 mL 발색 반응) ✕ 시험용액 희석배수
	10(효소반응 시간, 분) ✕ 5(검체 무게, g)