6.13.6히스타민

가. 시험법 적용범위

수산물 등 식품 중 히스타민(histamine) 분석에 적용한다.

나. 분석원리

식품 중 히스타민을 염산으로 추출하여 염화단실(dansyl chloride)로 유도체화 한 후 고속액체크로마토그래프를 이용하여 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프 : 자외부흡광검출기를 사용한다.

라. 시약 및 시액

1) 아세토니트릴 : HPLC용 또는 이와 동등한 것

2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

3) 0.1 N 염산 : 10 N 염산을 10 mL 취해 물을 가하여 1 L로 한다.

4) 포화탄산나트륨용액 : 탄산나트륨을 약 46 g을 취하여 물을 가해 100 mL로 한다.

5) 1% 염화단실(dnsyl chloride)아세톤용액 : 염화단실을 1 g을 취하여 아세톤을 가해 100 mL로 한다.

6) 10% 프롤린(proline)용액 : 프롤린 10 g을 취하여 물을 가해 100 mL로 한다.

7) 에테르 : 일반시약용 또는 이와 동등 한 것

8) 표준원액 : 히스타민을 정밀히 달아 0.1 N 염산에 녹여 1 mg/mL가 되게 한다.

9) 내부표준원액 : 1,7-디아미노헵탄(diaminoheptane) 표준품을 정밀히 달아 0.1 N 염산에 녹여 5 mg/mL가 되게 한다.

10) 표준용액 : 각각의 표준원액을 취하여 0.1 N 염산을 가해 각각의 농도가 50 μg/mL가 되게 한다.

11) 내부표준용액 : 내부표준원액에 0.1 N 염산을 가해 100 μg/mL가 되게 한다.

12) 검량곡선표준용액 : 표준용액에 0.1 N 염산을 가해 적당한 5개 농도(μg/mL)가 되게 조제하여 사용한다.

13) 시스템적합성용액 : 캐더버린(cadarverine) 및 히스타민을 취하여 0.1 N 염산을 가해 각각의 농도가 50 μg/mL가 되게 한다.

마. 시험용액의 조제

검체 5 g을 정확하게 취하여 0.1 N 염산을 25 mL을 가한 후 균질화하고 이것을 원심분리(4,000 G, 4℃, 15 min)한 후 여과하여 취하는 조작을 2회 반복하여 얻은 상층액을 합치고 0.1 N 염산을 가해 50 mL로 한 것을 시험용액으로 한다.

바. 유도체화

표준용액 및 시험용액 각각 1 mL을 마개 달린 유리시험관에 취한 다음 내부표준용액 100 μL를 가한 후 포화탄산나트륨용액 0.5 mL와 1% 염화단실아세톤용액 0.8 mL을 가하여 혼합한 후 마개를 하여 45℃에서 1시간 유도체화 한다. 유도체화 시킨 표준용액 및 시험용액에 10% 프롤린용액 0.5 mL 및 에테르 5 mL을 가하여 약 10분간 진탕하고 상층액을 취하여 질소 농축한 뒤 아세토니트릴 1 mL를 가하여 여과한 것을 고속액체크로마토그래프로 분석한다.

사. 시험조작

1) 액체크로마토그래프의 측정조건

가) 검출기 : 자외부흡광검출기 (UV), 254 nm

나) 칼럼 : C18 (4.6 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

다) 칼럼온도 : 40℃

라) 이동상 : 아세토니트릴과 물의 혼합액 (55% 아세토니트릴을 최초 10분간 유지 후 15분까지 65%, 20분까지 80%로 하여 5분간 유지 후, 30분까지 90%로 하여 5분간 유지시킨다.)

마) 이동상유량 : 1 mL/min

바) 시스템적합성 : 시스템적합성용액 10 μL를 가지고 위의 조건으로 조작할 때 캐더버린, 히스타민의 순서로 유출되고 그 분리도가 1.5 이상이어야 한다.

2) 정성시험

시험용액 크로마토그램 상의 히스타민의 피크 머무름 시간(retention time)은 각각 표준물질의 피크 머무름 시간과 일치하여야 한다.

3) 정량시험

각 표준용액의 표준물질과 내부표준물질의 면적비 [AS/AIS]를 Y축으로 하고 검량곡선표준용액의 히스타민의 농도(μg/g)를 X축으로 하여 검량곡선을 작성하고 시험용액과 내부표준물질의 면적비[ASAM/ASAMIS]를 Y축에 대입하여 히스타민의 농도를 계산한다.

AS : 표준용액의 표준물질 피크면적

AIS : 표준용액의 내부표준물질 피크면적

ASAM : 시험용액의 히스타민 피크면적

ASAMIS : 시험용액의 내부표준물질 피크면적