7.3.2.17에톡시퀸(Ethoxyquin)

가. 시험법 적용범위수산물 등에 적용한다.

나. 분석원리시료 중의 에톡시퀸과 에톡시퀸다이머를 아세토니트릴로 추출하고 QuEChERS시약을 이용하여 지방을 제거한 다음, PSA, C18, MgSO4로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

다. 장치

1) 액체
크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액 : 100 mL 용량플라스크에 각각의 표준품을 정밀히 달아 메탄올(에톡시퀸) 또는 아세토니트릴(에톡시퀸다이머)에 녹여 100mg/L가 되게 한다.

4)혼합표준용액 : 각각의 표준원액을 아세토니트릴로 희석하여 필요한 농도가 되게 한다.

5) 10 mM 포름산 암모늄 용액 : 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 암모늄 0.63 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

6) 아스코르브산 및 아스코르브산 나트륨 혼합용액(AA혼합용액) : 100 mL 용량플라스크에 아스코르브산 7.5 g과 아스코르브산 나트륨 7.5 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

7) QuEChERS시약 : QuEChERS pouch(sodium citrate 1 g, NaCl 1 g, MgSO4 4g, Sodium sesquihydrate 0.5 g) 또는 이와 동등한 것

8) 기타시약 : 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액의 조제

1) 추출
균질화한 시료 2 g 을 정밀히 달아 50 mL 폴리프로필렌 재질의 시험관에 취하고 AA혼합용액 0.5 mL를 넣어 가볍게 흔들어 섞는다. 물 5 mL와 아세토니트릴 10 mL를 넣고 15분간 흔들어 섞은 다음 QuEChERS 시약 6.5 g을 넣어 1분간 흔들어 섞은 후 4,700G, 4℃에서 5분간 원심분리 한다. 상층액을 150 mg PSA, 150 mg C18과 900 mg MgSO4가 담겨진 50 mL 폴리프로필렌 재질의 튜브에 취한 후 1분간 흔들어 섞고 4,700G, 4℃에서 5분간 원심분리 한다. 정제된 상층액 1 mL를멤브레인 필터(Nylon, 0.2 μm)로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼 : C18(2.1 mm × 150 mm, 2.7 µm) 또는 이와 동등한 것

나) 컬럼 온도 : 40℃

다) 이동상

(1) 이동상 A : 10 mM 포름산 암모늄 용액

(2) 이동상 B : 아세토니트릴

(3)농도구배조건

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	40	60
1	40	60
8	0	100
9	0	100
9.5	40	60
12	40	60

라) 이동상 유속 : 0.3 mL/분

마) 주입량 : 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법 : ESI positive-ion mode

나) Capillary temperature : 350℃

다) Collision gas : 아르곤(Ar)

라) 액체크로마토그래프-질량분석기 분석을 위한 특성이온

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	선구이온 (Precusor ion,m/z)	생성이온 (Product ion,m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
에톡시퀸 (Ethoxyquin)	3.62	217.3	218	1481)	20
				134	20
				176	18
에톡시퀸 다이머 (Ethoxyquin dimer)	8.92	432.6	433	2161)	25
				188	35
				375	29

1)정량이온

사. 정성 및 확인시험위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(Precursor ion) 및 생성이온(Product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(Ion ratio)을 비교하여 그 비율이 허용범위(± 20∼30%) 이내에서 일치하여야 한다주1). 확인시험의 경우, 음성대조시료(Negative control sample)에 측정물질을 첨가한 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액으로서 비교한다.

주1. 생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율(%)	허용범위
> 50%	± 20%
> 20%, ≤ 50%	± 25%
> 10%, ≤ 20%	± 30%

1) 표준품 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프-질량분석기에서 표준품의 크로마토그램 예시.

에톡시퀸 표준품(3.62분)

그림 2. 액체크로마토그래프-질량분석기에서 표준품의 크로마토그램 예시.

에톡시퀸 다이머 표준품(8.92분)

아. 정량시험

1) 정량
조직표준곡선(Tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당물질이 검출되지 않은 음성대조시료(Negative control sample)를 2 g씩 준비한 후 공시료를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여 표준용액을 제조한다. 확인시험과 같은 조건에서 공시료를 포함하여 각 농도별 첨가시료에서 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한 후 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(Quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 산출된 시험용액 중 검출농도, 시료량과 시험용액의 부피를 고려하여 정량한다.

2) 정량한계
에톡시퀸(Ethoxyquin) : 0.01 mg/kg 에톡시퀸 다이머(Ethoxyquin dimer) : 0.01 mg/kg