8.2.1.2 EEC 4-plate 법

1) 시험법 적용범위

식육에 적용한다.

2) 분석원리

Bacillus subtilis(Bs)와Micrococcus luteus(Ml) 두 종류의 균주를 사용하고 배지의 pH조건을 6.0, 7.2, 8.0으로 하여 항균물질을 확인한다.

3) 시험재료

가) 시험균

(1)Bacillus subtilis
BGA

(2)Micrococcus luteus
ATCC9341

나) 배지

(1) 계대용: nutrient agar(NA)

(2) 증균용: tryptic soy broth(TSB)

(3) 시험용: test agar(pH 6.0, pH 7.2, pH 8.0)

(4) 아포조제용 AK #2 sporulating agar(BBL)

(5) 균수 측정용: plate count agar(PCA) 또는 nutrient agar

다) 시험용 기구

(1) 디스크: 평판검사용 감수성 디스크(직경 6 mm), 지육검사용 디스크(직경 10 mm)

(2) 페트리접시: 87 × 15 mm 또는 이와 동등한 것

(3) 기타: 균질기, 캘리퍼스 또는 눈금자, 원심분리관, 항온수조(50℃), 배양기(30℃), 멸균 피펫(10 mL), roux bottle, 외과용 메스 등

4) 시험균액 조제

가)B.subtilisBGA 아포액 조제

물1 L에 해당하는 AK #2 sporulating agar(BBL) 또는 MnSO4·H2O 0.05 g을 보충한 nutrient agar에 agar 5 g을 보충하여 배양병(Roux bottle)에 250∼300 mL를 분주하여 121℃에서 15분간 멸균한 후 굳힌다. Nutrient agar 사면배지에 37℃에서 12시간 배양한 종균을 멸균수 2∼3 mL로 집균하여 roux bottle에 이식한다. 37℃, 18∼24시간 배양한 후 실온에 6일간 방치한 후 멸균 유리구슬(직경 4 mm)과 멸균수 25 mL를 넣고 조심스럽게 흔들어 집균하여 멸균 원심분리관에 옮긴 후 65℃에서 30분간 가열한다.3,000G로10분간 원심 분리하여 상층액을 제거하고 침전물에 일정량의 물을 넣어 부유시켜 원심분리한다. 이와같이 침전물에멸균수로 부유하여 원심분리하는 세척과정을 총 3회 반복한다. 마지막으로 원심분리하여 상층액을 버리고 남은 침전물에 멸균수 20 mL로 재부유시켜 70℃에서 30분간 가열한다. 이 아포원액을 plate count agar(PCA) 또는 nutrient agar를 이용해 아포액의 농도를 측정하여 멸균수로107∼108CFU/mL가 되도록 조정하고 4℃에서 냉장보관하면서 사용한다.

나)M.luteusATCC 9341 균액

Tryptic soy broth(TSB) 20 mL에 계대 보존균을 백금이(직경 2 mm)로 1 loopful 접종한 후 32℃ 항온수조에서 16시간 동안 80 rpm으로흔들어 섞어주며배양한다. 이 균액 1 mL를멸균수19 mL에 희석하여 냉장보관하면서 1주일간 사용한다. 이때 균액농도는2x107CFU/mL이다.

※ 아포액의 농도 측정 멸균수를 사용하여 아포원액을 단계 희석하여 10-4∼10-7이 되는 희석용액을 만든다. 희석용액 1 mL를 희석농도별 3개씩 패트리디쉬에 분주한다. 여기에 멸균하여 약 50℃로 유지한 plate count agar 또는 nutrient agar 배지를 적당량 넣고 좌우로 잘 흔들어 희석균액과 배지를 고르게 혼합하여 굳힌다. 그 위에 같은 배지를 적당량 중층시켜 굳힌 후 30℃ 배양기에서 48시간 배양한다. 집락수가 30∼300개 되는 희석배수의 plate를 선택하여 평균집락수를 구하고 아포원액의 mL당 아포 농도를 환산한다. 예를 들어 10-6희석 농도에서 평균 집락수가 50개일 경우, 아포 원액의 균수는 5×107CFU/mL이다.

5) 시험용액의 조제

가) Penicillin G(PG) 용액

100 mL의 용량플라스크에 PG․Na 또는 PG․K 60 mg을 취하여 멸균수로 표시선까지 채운 후 1,000배 희석하여 1 IU/mL(또는 0.6 mg/L)가 되도록 희석하여 사용한다(PG 1 unit= 0.6 μg).

나) Sulfamethazine(SMZ) 용액

100 mL의 용량플라스크에 100 mg의 SMZ를 취하여 메탄올 10 mL로 녹인 후 멸균수로 표시선까지 채워 1,000 mg/L가 되도록 한다. 이 용액을 50 mg/L가 되도록 희석하여 사용한다.

다) Streptomycin(SM) 용액

100 mL 용량플라스크에 SM 100 mg을 취하여 표시선까지 멸균수로 채워 1,000 mg/L가 되도록 한다. 이 용액을 50 mg/L가 되도록 희석하여 사용한다.

라) Trimethoprim(TMP) 용액

100 mL 용량플라스크에 10 mg의 TMP를 취하여 100 mL의 용량플라스크에 취해메탄올 10 mL로 녹인 후 멸균수로 표시선까지 채워 100 mg/L가 되도록 한다. 이 용액을 10 mg/L가 되도록 희석하여 사용한다.

6) 시험용 평판 조제

※ 평판배지 조제 Peptone 6.9 g, NaCl 5.1 g, KH2PO41.0 g, agar 13.0 g과물 1 L를 넣고 가열하여 녹인다. 4개의 삼각플라스크에 동일한 양을 분주한 후 고압증기 멸균하여 50℃ 항온수조에서 2시간 동안 방치한다. 1 N NaOH 또는 1 N HCl을 사용하여 pH를 6.0, 7.2, 8.0으로 맞춘다.(Bs: pH 6.0, 7.2, 8.0 / Ml: pH 8.0)

가)Bacillus subtilis(Bs) 평판

3종류의 Bs 배지(pH 6.0, 7.2, 8.0)에 2×106CFU/mL농도로 희석한 Bs 아포액을 65℃에서 30분간 가열한 후 배지 100 mL당 1 mL씩을 넣고 혼합한다.(Bs pH 7.2 평판제조시에는 Bs 아포액을 넣을 때 TMP 10 mg/L 용액도 함께 배지 100 mL 당 1 mL 넣고 혼합한다.) 피펫으로 6 mL씩 페트리디쉬(87 × 15 mm)에 분주하여 뚜껑을 살짝 열어 둔 상태로 30분간 방치한 후 사용한다. 사용하고 남은 시험용 평판은 냉장보관하면서 2∼3일 이내에 사용한다. 이때 제조한 Bs(pH 6.0, 7.2, 8.0)의 농도는 2×104CFU/mL이다.

나)Micrococcus luteus(Ml) 평판

M.l 배지(pH 8.0)에 약 2×107CFU로 희석한 Ml 균액을 배지 100 mL 당 1 mL를 넣고 혼합한다. 피펫으로 6 mL씩 페트리디쉬에 분주하여 뚜껑을 살짝 열어 둔 상태로 30분간 방치한 후 사용한다. 사용하고 남은 시험용 평판은 냉장보관하면서 1주일 이내에 사용한다. 이때 제조한 Ml(pH 8.0)의 농도는 2×105CFU/mL이다.

7) 시험용 평판 및 시료의 검사

가) 시험용 평판의 검사

직경 6 mm디스크에 Penicillin G, Sulfamethazine, Streptomycin 용액을 10 μg씩 흡습시킨 후주1)의표와 같이 해당되는 시험용 평판에 올려놓고, 32℃에서 16시간 배양하여 시험균의 저지환을 확인한다. 저지환의 크기가
주1)과 같이 디스크 직경 6 mm를 포함하여 12∼14 mm 이상이어야 한다.

주1)시험용평판의 검사조건

시험용평판	항균물질	표준용액농도	디스크당 함량	최소주변억제대
Bs(pH 6.0) Bs(pH 7.2) Bs(pH 8.0) Ml(pH 8.0)	Penicillin G-Na Sulfamethazine Streptomycin Streptomycin	0.6 μg/mL 50 μg/mL 50 μg/mL 50 μg/mL	0.006 μg 0.5 μg 0.5 μg 0.5 μg	6 mm 이상 6 mm 이상 8 mm 이상 6 mm 이상

나) 시료의 검사

(1) 디스크법

식육의 근육을 절개한 후 핀셋으로 시료 당 지육 검사용 10 mm 디스크 4개씩을 삽입하여 30∼60분간 육즙을 흡수시킨다. 육즙을 흡수시킨 후 디스크를 꺼내어 4종류의 검사용 평판에 하나씩 올려놓고 가볍게 눌러주고 실온에 약 30분간 방치한 후 32℃ 배양기에 넣어 16시간 배양하여 결과를 판정한다.

(2) 직접법

식육을 사방 1 cm, 두께 2 mm 정도로 잘라 4 종류의 검사용 평판에 각각 올려놓고 실온에서 약 30분간 방치한 후 페트리디쉬를 뒤집지 않고 배양기에 넣어 32℃에서 16시간 배양하여 결과를 판정한다.

8) 시험결과 판정

가) 결과판정 방법

디스크법의 경우 디스크 직경 10 mm를 포함하여 저지환이 14 mm 이상인 평판이 하나 이상일 경우 해당시료를 양성으로 판정하며, 직접법의 경우 저지환의 폭이 1 mm 이상인 평판이 하나 이상일 때 양성으로 판정한다. 세균오염 등으로 인해 저지환이 불분명할 경우는 시험을 반복하고 재시험시 양성이 아닐 경우에는 음성으로 판정한다.

나) 양성시료의 항균물질 계열 추정

각 항균물질의 표준용액을 각 디스크 당 75 μL씩 흡수시킨 후 배양했을 때주2)의 표와 같이 4종의 평판에서 저지환이 형성되는 양상을 비교하여 잔류 항균물질의 계열을 추정한다. 그러나 이 시험법은 잔류량이 매우 낮거나 높을 경우, 또는 여러 항균물질이 복합적으로 잔류할 경우는 추정이 불가능하므로 양성인 시료는 반드시 정량시험법에 따라 확인하여야 한다.

주2)EEC 4-plate 법의 표준 항균물질에 대한 최저검출한계 (mg/L)

항 균 물 질	Bs 평판 pH 6.0	Bs 평판 pH 7.2	Bs 평판 pH 8.0	Ml 평판 pH 8.0
β-Lactams Penicillin G Ampicillin Amoxicillin Cloxacillin Nafcillin Cephalexin Cephazolin   Aminoglycosides Streptomycin Dihydrostre ptomycin Gentamicin Neomycin   Macrolides Erythromycin Spiramycin Tylosin Oleandomycin Lincomycin   Tetracyclines Tetracycline Chlortetracycline Oxytetracycline Sulfonamides Sulfamethazine Sulfamerazine Sulfadimethoxine Sulfamonomethoxine Sulfaquinoxaline Sulfathiazole   Polypeptides Bacitracin Polyethers Monensin Nitrofurans Furazolidone   Quinolones Oxolinic acid   Others Spectinomycin Chloramphenicol Trimethoprim	0.025 0.1 0.25 1 1 1 1     5 5 10 50     2.5 2.5 2.5 10 100     0.25 0.05 0.25   25 10 1 0.5 2.5 10     100   5   0.25     0.5     50 5 5	0.05 0.05 0.1 1 2.5 5 2.5     1 1 0.5 2.5     0.1 0.5 0.5 0.25 1     1 0.25 0.5   1 0.5 0.25 0.25 0.5 0.25     >100   5   0.1     1     25 2.5 2.5	0.05 0.05 0.25 2.5 2.5 10 2.5     0.5 0.5 0.5 1     0.05 0.5 0.5 0.5 25     5 2.5 2.5   100 100 50 100 50 50     >100   5   0.1     1     25 2.5 2.5	0.025 0.025 0.05 2.5 0.05 2.5 100     2.5 2.5 5 5     0.05 0.5 0.5 0.1 0.1     10 10 10   >100 >100 >100 100 >100 >100     10   10   >100     >100     50 2.5 25