8.2.1.3 TTC-II 법

1) 시험법 적용범위

유에 적용한다.

2) 분석원리

Streptococcus thermophilus균주에 무색의 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC)가 산화환원 반응 후 적색 triphenyl formazan 형성 유무를 통해 설파계, 페니실린계 항균제를 확인한다.

3) 시험재료

가) 시험균

Streptococcus thermophilus(ATCC 14485)

나) 배지

항균물질이 없는 10% 멸균탈지유배지를 공시균주 배양용 배지로 사용한다.

다) 시약

(1) Trimethoprim (TMP)

(2) p-Aminobenzoic acid (PABA)

(3) 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC)

(4) Penicillinase (1,000 unit)

라) 시험기구

4) 시험용 배양균액 조제

ⓐStreptococcus thermophilus균주를 10% 멸지탈지유배지에 접종하여 37℃에서 12시간 배양한다. ⓑ 10% 멸균탈지유배지를 따로 준비한다. ⓐ와 ⓑ를 1:1로 혼합하여 시험용 배양균액으로 사용한다.

5) 시험 용액의 조제

가) TTC 용액

멸균수와 TTC를 25:1(v/v)의 비율로 섞어 4% TTC 용액을 제조한 후 발색되지 않도록 7℃ 이하의 냉암소에서 보관한다.

나) TMP 용액

100 mL 용량플라스크에 TMP 50 mg을 취해 methanol 10 mL에 녹인 후멸균수로 표시선까지 채운다(500 mg/L).멸균수로 10배 희석하여 50 mg/L가 되도록 제조한 후 시험용액으로 사용한다. 제조 후 냉장보관하고 2주 이내에 사용한다.

다) PABA 용액

100 mL 용량플라스크에 PABA 500 mg을 취해멸균수약 50 mL를 넣고 가온하여 녹인 후멸균수로 표시선까지 채운다(5,000 mg/L).멸균수로 10배 희석하여500 mg/L가 되도록 제조한 후 시험용액으로 사용한다. 제조 후 실온보관하고 2주 이내에 사용한다.

라) Penicillinase 용액

Penicillinase(1,000 IU)를멸균수1 mL에 녹여 시험용액으로 사용한다.

5) 시료의 검사

가) 스크리닝법

마개달린 멸균시험관 2개에 Zero control(TMP 무첨가 음성대조)과 TMP control(TMP 첨가 음성대조)로 표기하고 검사할 시료당 1개의 시험관에 시료번호를 기입한다. 검사할 시료의 멸균시험관에 시료 번호를 기입한 후 시료(유)를 각각 8 mL씩 취한다. 이때 대조용주1)으로 사용할 Zero 및 TMP control시험관에는 항균물질이 들어있지 않는 유 각 8 mL를 취한다. Zero control에는 멸균수1 mL를 넣고, TMP control과 검사할 시료의 시험관에는 TMP 용액(50 mg/L) 1 mL를 넣고 혼합한다. 80∼84℃의 항온수조에서 2.5분간 가열한 후 바로 수돗물에 담가 37℃ 이하로 급냉시킨다. 시험용 배양균액 (1:1 희석균액)을 무균적으로 각 1 mL씩 접종하여 혼합하고 36.5∼37.5℃의 항온수조에서 2시간 동안 배양한다. TTC 용액 0.3 mL를 넣은 후 36.5∼37.5℃에서 30∼60분 동안 반응시킨다. TMP control 시료의 색상이 음성대조 시료의 색상과 거의 같은 시점을 반응 종료시간으로 한다.

주1)대조용 시료 대조용 원유시료는 사료첨가제 혹은 치료약제 등 을 투여하지 않은 원유를 채취하여 4℃ 냉장보관하면서 사용하고, 2∼3 일내 사용하지 못할 경우 -20℃ 혹은 -80℃에 보관하여 필요시 해동하여 사용한다. 탈지유를 검사할 경우 대조용 시료로는 항균물질이 들어 있지 않은 10% 멸균탈지유를 사용한다.

나) 설파제 및 페니실린계 항균물질 확인시험

검사할 양성시료마다 마개달린 3개의 멸균시험관에 TMP tube, PABA tube 그리고 penase tube로 표기하고 시료번호도 기입한다. 3개의 시험관에 양성시료를 각 8 mL씩 취한 후 TMP tube(TMP용액 첨가용 시험관)와 penase tube(TMP 용액 및 penicillinase용액 첨가용 시험관)에는 TMP 용액(50 mg/L)을 각 1 mL씩 넣고, PABA tube(PABA용액 첨가용 시험관)에는 PABA 용액(500 mg/L) 1 mL를 넣고 혼합한다. 80∼84℃의 항온수조에서 2.5분간 가열한 후 바로 수돗물에 담가 37℃ 이하로 급냉시킨다. Penase tube에만 penicillinase 용액 100 μL를 넣고 혼합한다. 시험용 배양균액 (1:1 희석균액)을 무균적으로 각 1 mL씩 접종하여 혼합하고 36.5∼37.5℃의 항온수조에서 2시간 동안 배양한다. 300 μL의 TTC 용액을 넣은 후 36.5∼37.5℃에서 30∼60분 동안 반응시킨다. TMP control 시료의 색상이 음성대조 시료의 색상과 거의 같은 시점을 반응 종료시간으로 한다.

6) 시험 결과 판정

가) 스크리닝법

TMP control의 색상을 기준으로 하여 시료의 색상이 TMP control 시료의 연분홍색보다 현저히 옅을 경우 양성으로 판정하고 같거나 진하면 음성으로 판정한다. 시료가 양성인 경우, 정량시험법에 따라 확인하여야 한다.

나) 설파제 및 페니실린계 항균물질 확인시험

TMP control의 색상을 기준으로 스크리닝법과 같이 판정하고,주2)표와 같이 결과를 추정할 수 있다.

주2)판정기준

TMP tube	Penase tube	PABA tube	결과판정
음 성	음성	음성	음성
양 성	양성	음성	양성 (설파제)
양 성	음성	양성	양성 (페니실린계)
양 성	양성	양성	양성*

*항균물질이 복합적으로 잔류될 경우 설파제나 페니실린계 항균물질도 동시에 검출될 수 있음