1) 시험법 적용범위

축산물에 적용한다.

2) 분석원리

시료중 분석대상물질을포름산암모늄 함유 아세토니트릴:물(4:1, v/v) 혼합용액으로 추출하고C18을 이용한 분산고체상추출법으로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

3) 장치

액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액: 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

라) 표준용액:각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 물로 희석하여 사용한다.

마) 200 mM포름산암모늄 수용액: 100 mL 용량플라스크에포름산암모늄1.25 g을 넣고 물로표시선까지 채운다.

바) 0.1%포름산(formic acid)수용액: 1,000 mL 용량플라스크에포름산1 mL을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

사)0.1%포름산함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에포름산1 mL을 넣고 아세토니트릴로표시선까지 채운다.

아) C18충전제: 입자크기 37∼55 μm, 공극크기 125 Å 또는 이와 동등한 것

자) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

5) 시험용액의 조제

균질화한시료2 g을 50 mL 원심 분리관에 취하고 200 mM포름산암모늄 수용액0.1 mL과 물 2 mL을 넣어흔들어 섞어 추출한다. 아세토니트릴 8 mL을 넣고 15분간 강하게흔들어 섞어혼합한 후 10,000G에서10분간 원심분리한다. 상층액을 취하여 C18분말 500 mg을 분산시킨 후, 헥산 10 mL을넣고1분간흔들어 섞는다. 10,000G에서 5분간 원심분리하고, 눈금이 표시된 시험관에 하층액 5 mL 취해 옮긴 후,40℃ 이하에서1 mL가되도록 질소 농축한다. 농축액 1 mL 중 0.5 mL을 취하여0.2 μm PVDF (polyvinylidenefluoride) 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 측정조건

(1) 컬럼: C18(2.1 mm × 50 mm, 1.7 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상

(가) 이동상 A: 0.1%포름산수용액

(나) 이동상 B: 0.1%포름산함유 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0.00	90	10
0.20	90	10
2.50	5	95
3.50	5	95
3.51	90	10

(3) 유속: 0.5 mL/분

(4)컬럼온도: 40℃

(5) 주입량: 5 μL

나) 질량분석기 조건

(1) Ionizationmode: ESI(Positive, negative)

(2) Capillary temperature: 350℃

(3) Collision gas: Ar(아르곤)

연번	물질명 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion,m/z)	생성이온 (Product ion,m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	디클로페낙 (Diclofenac)	2.20	Negative	295.0	294.1	250.1	10
						214.2	20
2	멜록시캄 (Meloxicam)	2.02	Negative	351.0	350.0	146.1	20
						286.1	15
3	아세틸 살리실산 (Acetyl salicylic acid)	1.53	Negative	180.0	137.0	93.1	15
						65.2	30
4	카프로펜 (Carprofen)	2.15	Negative	273.1	272.0	228.0	15
						226.0	30
5	케토프로펜 (Ketoprofen)	2.00	Positive	254.1	255.0	209.1	15
						105.1	25
6	톨페남산 (Tolfenamic acid)	2.36	Negative	261.1	260.0	216.1	15
						35.1	25
7	파라세타몰 (Paracetamol)	0.56	Positive	151.1	152.0	110.1	20
						65.1	30
8	페닐부타존 (Phenylbutazone)	2.27	Negative	308.2	307.1	131.1	25
						279.2	20
9	플루닉신 (Flunixin)	2.05	Negative	296.1	295.0	251.1	15
						209.1	30

(4) 분석대상물질의 개별 조건

※ 밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

7) 정성 및 확인시험

가) 정성 및 확인

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고,표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다. 확인시험의 경우, 음성시료
(blank sample)에 해당 물질을 넣은 것을 시료와 동일하게 전처리하여 얻은 표준용액 으로서 비교한다.

주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율 (Base peak에 대한 %)	허용범위
> 50%	± 20%
> 20%, ≤ 50%	± 25%
> 10%, ≤ 20%	± 30%

나) 표준품 크로마토그램

그림 1. 비스테로이드성 항염증제 표준품의 크로마토그램(0.1 mg/kg)

8) 정량시험

가) 정성시험에서 검출된 잔류동물용의약품은 식품공전 8.3의 정량시험법을 따른다.

나) 8.3 정량시험법에 해당물질의 시험법이 없을 경우,조직표준곡선(tissue standard curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 음성시료(blank sample) 2 g씩 준비한 후, 음성시료(blank sample)를 포함하여 5개 이상의 농도로 전처리하여 표준용액을 제조한다. 각 농도별 첨가시료에서 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한 후 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 산출된 시험용액 중 검출농도, 시료량과 최종 시험용액의 부피를 고려하여 정량한다.