8.3.85 세파드록실(Cefadroxil)

1) 시험법 적용범위

수산물 등에 적용한다.

2) 분석원리

검체 중 분석대상물질을 물과 아세토니트릴을 가하여 초음파로 추출하고 헥산으로 지방을 제거하여 MCX 카트리지로 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

3) 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액 : 표준품을 100 mL 용량플라스크에 정밀히 달아 물에 녹여 100 mg/L가 되게 한다.

라) 표준용액 : 표준원액을 0.1% 개미산으로 희석하여 적당한 농도가 되게 한다.

마) MCX 카트리지(3 mL, 60 mg) 또는 이와 동등한 것

바) 2% 개미산(Formic acid) : 100 mL 용량플라스크에 개미산 2 mL을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

사) 5% 수산화암모늄을 함유한 메탄올 : 100 mL 용량플라스크에 수산화암모늄 5 mL을 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.

아) 0.1% 개미산을 함유한 물 : 1,000 mL 용량플라스크에 개미산 1 mL을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

자) 기타시약 : 특급

5) 시험용액의 조제

가) 추출

균질화한 검체 2 g을 50 mL 원심분리관에 취한다. 여기에 ⓐ(증류수 1 mL과 아세토니트릴 4 mL을 가하고 흔들어 섞은 후 10분간 초음파 추출한 뒤 9,000G에서 10분간 원심분리하여 상층액을 취한다). 다시한번 ⓑ(잔류물에 증류수 1 mL과 아세토니트릴 4 mL을 가하고 흔들어 섞은 후 10분간 초음파 추출한 뒤 9,000G에서 10분간 원심분리 한다). ⓐ와 ⓑ의 상층액을 합한 후 헥산 10 mL을 10분간 진탕 혼합 한다. 하층액을 40℃에서 농축한 후 0.1% 개미산을 함유한 물 2 mL로 재용해한 것을 추출액으로 한다. 미리 메탄올 2 mL과 증류수 1 mL로 활성화시킨 MCX 카트리지에 추출액을 흡착시키고 2% 개미산 2 mL과 메탄올 2 mL로 세척한 후, 5% 수산화암모늄을 함유한 메탄올 2 mL로 용출시킨다. 용출액은 40℃에서 질소농축한 후 0.1% 개미산을 함유한 물 2 mL에 녹인 후 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 측정조건

(1) 칼럼 : C18(2.1 ｘ 150 mm, 3 µm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상 :

(가) 이동상 A : 0.1% 개미산을 함유한 물

(나) 이동상 B : 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	100	0
7	85	15
15	80	20
20	100	0
25	100	0

(3) 유속 : 0.2 mL/분

(4) 칼럼온도 : 35℃

(5) 주입량 : 5 μL

나) 질량분석기 조건

(1) Ionization : ESI(Positive)

(2) Capillary temperature : 350℃

(3) Collision gas : N2(질소)

(4) 분석대상물질 조건

물질명 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collisionenergy, eV)
세파드록실 (Cefadroxil)	9.21	363.39	364	114	22
				208	15

※ 밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

※ 각 생성이온(Product ion)에 대한 질량분석기의 기기조건은 사용기기의 최적값으로 변경하여 사용할 수 있으며, 제시된 이외의 생성이온도 적용이 가능함

7) 정성시험

가) 정성

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(Precursor ion) 및 생성이온(Product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(Response ratio)을 비교하여 그 비율이 20～30% 이내에서 일치하여야 한다. ※주1 참조

주1. 생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율(%)	허용범위
> 50%	≤ 20%
20% ～ 50%	≤ 25%
> 10% ～ < 20%	≤ 30%

나) 표준품 크로마토그램

그림 1.세파드록실(9.21분)표준품의 크로마토그램(1 mg/kg)

8) 정량시험

가) 정량

정성시험과 똑같은 조건에서 표준용액을 일정농도로 제조한 후 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성하고, 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(Quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 각각 정량한다.

나) 정량한계

세파드록실(Cefadroxil) : 0.005 mg/kg