8.3.88 니트로푸라존(Nitrofurazone)

1) 시험법 적용범위

수산물 중 갑각류에 적용한다.

2) 분석원리

검체 중 니트로푸라존(Nitrofurazone)을 0.2% 메타인산/메탄올 혼합용액(6:4, v/v)으로 추출하고HLB(Hydrophilic lipophilic balance)카트리지로정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.니트로푸라존은 빛에쉽게 분해되므로 실험과정에사용되는 초자는 갈색유리병을 사용하거나호일로 감싸 빛을 차단하여 실험한다.

3) 장치

액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액:니트로푸라존 표준품을 정밀히 달아 아세토니트릴에 녹여 100mg/L가되게 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

라) 표준용액: 표준원액을 10 mM 암모늄아세테이트로 희석하여 사용한다.

마) 10 mM 암모늄아세테이트(Ammonium acetate) 용액:1,000 mL 용량플라스크에암모늄아세테이트 0.78 g을 넣고 물에 녹여 표시선까지채운다.

바) 0.2% 메타인산/메탄올 혼합용액(6:4, v/v):1,000 mL 용량플라스크에메타인산 2g을 넣고물에 녹여표시선까지 채운 후메탄올과 6:4의 비율로 혼합하여 추출용액으로 사용한다.

사) HLB(Hydrophilic lipophilic balance) 카트리지(6 mL, 200 mg) 또는 이와 동등한 것

아) 기타시약: 특급

자) 용기: 갈색 유리기구

5) 시험용액의 조제

균질화한 검체 5 g을 정밀히 달아 용기에 넣고0.2%메타인산/메탄올 혼합용액(6:4, v/v) 100 mL를 가한 후 1분간 균질화한다.이 용액을whatmanNo.6여과지가 깔린 부흐너깔때기로 감압 여과한다.이 여과액{단, (껍질을 포함하는) 민물새우의 경우 여과액을 4℃에서 12,000G로 10분간 원심분리한 후 상층액을 사용}은40°C 이하의 수욕 중에서 20〜30 mL가 되게 회전식 감압 농축한다. 미리 메탄올 5 mL, 물5 mL로활성화시킨HLB 카트리지에 추출액을 흡착시키고 10% 메탄올 5 mL로 세척한 뒤,메탄올 5 mL로 용출한다.용출액은 40℃ 수용액상에서질소농축한 후, 잔류물은 10 mM 암모늄아세테이트/아세토니트릴(3:7, v/v) 혼합용액 1 mL로 재용해하고0.2 μm 막 여과지(Nylon membrane filter)로 여과하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 측정조건

(1)칼럼 : C18(BEH, 2.1 × 50 mm, 1.7 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상

(가) 이동상 A: 10 mM 암모늄아세테이트

(나) 이동상 B: 아세토니트릴

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	95	5
0.5	95	5
1.5	70	30
2.0	70	30
3.0	95	5
5.0	95	5

(3) 유속: 0.3 mL/분

(4) 칼럼온도: 35℃

(5) 주입량: 5 μL

나) 질량분석기 조건

(1) Ionization: ESI(Negative)

(2) Capillary temperature: 350℃

(3) Capillary voltage: 2.8 kV

(4) Collision gas: 아르곤(Ar)

(5) 분석대상물질의 조건

물질명 (Compounds)	머무름 시간(분)	분자량	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
니트로푸라존 (Nitrofurazone)	1.87	198.1362	197.07	124.10	10
				149.92	10
				79.92	10

※밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

※각 생성이온(Production)에 대한 질량분석기의 기기조건은 사용기기의최적값으로 변경하여사용할 수 있으며, 제시된 이외의 생성이온도 적용이 가능함

7) 정성시험

가) 정성

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준물질 피크의머무름시간과 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액을 각각 질량분석기에 주입하였을 때 선구이온(Precursor ion) 및 생성이온(Product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의생성이온간반응세기의 비율(Response ratio)을 비교하여그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.

주1)생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율(%)	허용범위
> 50 %	≤ 20 %
> 20 % ∼ ≤ 50 %	≤ 25 %
> 10 % ∼ ≤ 20 %	≤ 30 %

나) 표준품 크로마토그램

그림 1. 니트로푸라존(1.86분, 0.005 mg/L) 표준품의 크로마토그램

8) 정량시험

가) 정량

정성시험과 똑같은 조건에서 표준용액을 일정농도로 제조한 후얻어진크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성하고,시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(Quantitative ion)의 각 피크 높이또는 피크 면적에 따라 각각 정량한다.

나) 정량한계

(1) 껍질을 포함하는 민물새우 : 0.005 mg/kg

(2) (1)을 제외한 갑각류(가식부) : 0.001 mg/kg