8.3.89 시프로헵타딘(Cyproheptadine), 더콴텔(Derquantel), 펄리마이신(Pirlimycin)

1) 시험법 적용범위

축‧수산물 등에 적용한다.

2) 분석원리

검체 중 분석대상물질을 80% 아세토니트릴로 추출하여 헥산으로 정제한 후 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

3) 장치

액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물: 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액: 각 표준품을100 mL 용량플라스크에 정밀히 달아 메탄올에 녹여100 mg/L이 되게 한다.

라) 혼합표준용액: 각 표준원액을 메탄올로 희석하여 적당한농도가되게 한다.

마) 0.1% 개미산(formic acid) 용액: 1,000 mL 용량플라스크에 개미산 1 mL을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

바) 0.1% 개미산 함유 메탄올 용액: 1,000 mL 용량플라스크에 개미산 1 mL을 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.

사)기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

5) 시험용액의 조제

가) 유를 제외한 축‧수산물

균질화한 검체 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 황산마그네슘 2 g (새우, 장어의 경우 1.5 g)과 80% 아세토니트릴 용액 10 mL을 가하여 15분간 진탕한 후, 2,200G에서 10분간 원심분리한다. 상층액을 50 mL 원심분리관에 취하여 헥산 10 mL를 넣고 30 초간 진탕한 후 2,200G에서 5분간 원심분리한다. 하층액(아세토니트릴층) 2 mL를 새로운 원심분리관에 취하여 50℃에서 질소농축한 후 잔류물에 0.1% 개미산/메탄올 혼합용액(1:1, v/v) 0.4 mL를 가하여 녹인 후 0.2 μm 막 여과지(PVDF membrane filter)로여과하여 시험용액으로 한다.

나) 유

균질화한 검체 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 황산마그네슘 1.5 g, 초산암모늄 1 g, 80% 아세토니트릴 용액 10 mL를 가하여 15분간 진탕한 후, 2,200G에서 10분간 원심분리한다. 상층액을 50 mL 원심분리관에 취하여헥산 10 mL를 넣고 30 초간 진탕하고 2,200G에서 5분간 원심분리한다. 하층액(아세토니트릴층) 2 mL를 새로운 원심분리관에 취하여 50℃에서질소농축한 후 잔류물에 0.1% 개미산/메탄올 혼합용액(1:1, v/v) 0.4 mL를가하여 녹인 후 0.2 μm 막 여과지(PVDF membrane filter)로여과하여 시험용액으로 한다.

6) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 측정조건

(1)칼럼：C18(Kinetex, 2.1 × 50 mm, 1.3 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상

(가) 이동상 A : 0.1% 개미산 용액

(나) 이동상 B : 0.1% 개미산 함유 메탄올 용액

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	90	10
10	10	90
15	10	90
15.1	90	10
18	90	10

(3) 유속 : 0.2 mL/분

(4) 칼럼온도 : 40℃

(5) 주입량 : 5 μL

나) 질량분석기 조건

(1) Ionization : ESI (Positive)

(2) Capillary temperature : 250℃

(3) Collision gas : Ar(아르곤)

(4) 분석대상물질의 개별 조건

연번	물질명 (Compound)	머무름 시간(분)	분자량	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision Energy,eV)
1	시프로헵타딘 (Cyproheptadine)	7.3	287.4	288.1	96.1	-26
					191.1	-29
					215.1	-47
2	더콴텔 (Derquantel)	6.1	479.6	480.3	462.2	-25
					405.3	-32
					148.1	-44
3	펄리마이신 (Pirlimycin)	6.0	410.1	411.2	112.2	-15
					56.1	-20
					363.1	-20

※밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

※각 생성이온(Production)에 대한 질량분석기의 기기조건은 사용기기의최적값으로 변경하여사용할 수 있으며, 제시된 이외의 생성이온도 적용이 가능함

7) 정성시험

가) 정성

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(Precursor ion) 및 생성이온(Product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(Response ratio)을비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.

주1. 생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율(%)	허용범위
> 50%	≤20%
> 20%∼≤ 50%	≤25%
> 10%∼≤ 20%	≤30%

나)표준품 크로마토그램

시프로헵타딘(7.3분)

더콴텔(6.1분)

펄리마이신(6.0분)

그림 1. 시프로헵타딘, 더콴텔, 펄리마이신 표준품의 크로마토그램(각 0.005 mg/L)

8) 정량시험

가) 정량

정성시험과 똑같은 조건에서 표준용액을 일정농도로 제조한 후 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성하고, 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(Quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 각각 정량한다.

나) 정량한계

시프로헵타딘(Cyproheptadine) : 0.005 mg/kg

더콴텔(Derquantel) : 0.0002 mg/kg

펄리마이신(Pirlimycin) : 0.005 mg/kg