8.3.111 루페뉴론(Lufenuron), 테플루벤주론(Teflubenzuron) 시험법

1) 시험법 적용범위

수산물 등에 적용한다.

2) 분석원리

검체 중의 루페뉴론과 테플루벤주론을 아세토니트릴로 추출하고 C18흡착제로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

3) 측정기기

액체크로마토그래프/질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액 : 1,000 mL 용량플라스크에 각각의 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 1,000 mg/L이 되게 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

라) 혼합표준용액 : 각 물질의 표준원액 1,000 mg/L 농도로부터 메탄올로 희석하여 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 mg/L 농도가 되게 한다. 다만, 기기의 특성 등 필요에 따라 농도를 조정하여 사용할 수 있다.

마) 5 mM 포름산암모늄 용액 : 1,000 mL 용량플라스크에 포름산암모늄 315.3 mg을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

바) 5 mM 포름산암모늄 함유 메탄올 용액 : 1,000 mL 용량플라스크에 포름산암모늄 315.3 mg을 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.

사) 기타시약 : 특급 또는 이와 동등한 것

5) 첨가시료의 조제

정량을 하는 경우 조직표준곡선(Tissue standard curve) 작성을 위하여 해당 물질이 검출되지 않은 음성대조시료(Negative control sample)2 g씩 준비한 후 공시료(Blank)를 제외하고 표준용액을 0.2 mL씩 넣어 0.0025, 0.005, 0.01, 0.02, 0.04 mg/kg가 되도록 조제한다.

6) 시험용액의 조제

균질화한 검체 2 g을 정밀히 달아 50 mL 폴리프로필렌 재질의 원심분리관에 취하고 물 2 mL와 아세토니트릴 10 mL를 넣고 5분간 진탕한다. 황산마그네슘 4 g과 초산나트륨 1 g을 넣고 20분간 진탕한 후 2,800G, 4℃에서 10분간 원심분리 한다. 원심분리한 상층액을 취하여 100 mg C18이 담긴 새로운 50 mL 폴리프로필렌 재질의 원심분리관에 옮기고 10분간 진탕한 후 2,800G, 4℃에서 10분간 원심분리 한다. 원심분리한 상층액을 취하여 새로운 50 mL 폴리프로필렌 재질의 원심분리관에 옮기고 50℃ 항온수조에서 질소 농축한다. 잔류물에 물/아세토니트릴(50:50, v/v) 2 mL를 넣어 재용해하고 0.2 μm 멤브레인 필터(PTFE membrane filter)로 여과하여 시험용액으로 한다.

7) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 측정조건

(1) 칼럼 : C
18(Phenomenex Kinetex, 2.1 mm i.d. × 150 mm, 2.6 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상

(가) 이동상 A : 5 mM 포름산암모늄 함유 메탄올 용액

(나) 이동상 B : 5 mM 포름산암모늄 용액

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0.0	20	80
1.0	20	80
5.0	80	20
10.0	90	10
15.0	90	10
15.1	20	80
20.0	20	80

(3) 유속 : 0.2 mL/분

(4) 칼럼온도 : 40℃

(5) 주입량 : 5 μL

나) 질량분석기 조건

(1) Ionization : ESI(Positive)

(2) Capillary temperature : 250℃

(3) Capillary voltage: 4.5 kV

(4) Collision gas : 아르곤(Ar)

물질명 (Compound)	머무름 시간(분) (Retention time, min)	분자량 (Molecular weight)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
루페뉴론 (Lufenuron)	8.5	511.2	511	158	23
				141	50
				113	53
테플루벤주론 (Teflubenzuron)	8.4	381.1	381	158	15
				141	37
				113	54

(5) 분석대상물질의 조건

※ 밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임.

※ 각 생성이온(Product ion)에 대한 질량분석기의 기기조건은 사용기기의 최적값으로 변경하여 사용할 수 있으며, 제시된 이외의 생성이온도 적용이 가능함.

8) 정성 및 확인시험

가) 정성 및 확인

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(Precursor ion) 및 생성이온(Product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(Responseratio)을 비교하여 그 비율이 주1)과 일치하여야 한다.

주1. 생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율(%)	허용범위
> 50 %	≤ 20 %
> 20 %, ≤ 50 %	≤ 25 %
> 10 %, ≤ 20 %	≤ 30 %

나) 표준품 첨가시료의 크로마토그램

9) 정량시험

가) 정량

정성 및 확인시험과 똑같은 조건에서 Blank 시료를 포함하여 각 농도별 첨가시료에서 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한 후 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(Quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 산출된 시험용액 중 검출농도, 검체량과 최종 시험용액의 부피를 고려하여 정량한다.

나) 정량한계

루페뉴론(Lufenuron) : 0.005 mg/kg

테플루벤주론(Teflubenzuron) : 0.005 mg/kg