8.3.112 루바베그론(Lubabegron) 시험법

1) 분석법 적용범위

축·수산물 등에 적용한다.

2) 분석원리

검체 중 분석대상물질을 아세트산 함유 아세토니트릴/메탄올 혼합용액(1:1, v/v)으로 추출하고 헥산 또는 일차이차아민(PSA)로 정제하여 액체크로마토그래프/질량분석기로 분석한다.

3) 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

4) 시약 및 시액

가) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

나) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

다) 표준원액 : 루바베그론 표준품을 메탄올에 녹여 100 mg/L가 되게 한다.

라) 표준용액 : 루바베그론 표준용액 100 mg/L 농도로부터 0.01, 0.02, 0.04, 0.08, 0.16 µg/mL 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 혼합한다.

마) 10 mM 아세테이트 완충용액(pH 4.6): 1,000 mL 용량플라스크에 아세트산나트륨 0.82g 을 넣고 물로 표시선까지 채운다. 아세트산으로 pH 4.6이 되도록 조정하여 사용한다.

바) 1% 아세트산(Acetic acid) 함유 아세토니트릴/메탄올 혼합용액(1:1, v/v): 100 mL 용량플라스크에 아세트산 1 mL을 넣고 아세토니트릴/메탄올(1:1, v/v) 혼합용액으로 표시선까지 채운다.

사) 0.1 mM 불화암모늄(Ammonium fluoride)용액: 1,000mL 용량플라스크 불화암모늄 3.7 mg을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

아) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

5) 첨가시료의 조제

정량을 하는 경우 조직표준곡선 작성을 위하여 루바베그론이 검출되지 않은 음성대조시료 2 g씩 6개를 준비한 후 Blank를 제외하고 각 표준용액을 0.2 mL씩 가하여 0.001, 0.002, 0.004, 0.008, 0.016 µg/g가 되도록 조제한다.

6) 시험용액의 조제

균질화한 검체 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하여 10 mM 아세테이트 완충용액 (pH 4.6) 2 mL 을 넣고 2분간 초음파 처리하여 균질화한다. β-글루쿠로니다제/아릴설파타제(β-lucuronidase/Arylsufatase) 20 μL첨가하고 65℃에서 1시간 중탕한 후 상온에서 냉각한다. 이 용액에 1% 아세트산 함유 아세토니트릴/메탄올 혼합용액을 12 mL 가하여 10분간 초음파 처리 후 15분간 진탕하고 4℃에서 9,300G로 10분간 원심분리한다. (㉠돼지고기를 제외한 축수산물의 경우, 새로운 50 mL 원심분리관에 상층액을 취하여 헥산 12 mL을 넣고 2분간 진탕한다. 4℃에서 9,300G로 5분간 원심분리한 후 하층액을 취하여 감압농축한다. ㉡돼지고기의 경우, PSA 500 mg 이 담겨진 50 mL 원심분리관에 상층액을 취하여 5분간 진탕한다.) 4℃에서 9,300G로 5분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 감압농축한다. 잔류물에 50% 메탄올 1 mL을 넣어 녹이고 상온에서 15,800G로 10분간 원심분리한 후 상층액을 시험용액으로 한다.

7) 시험조작

가) 액체크로마토그래프 측정조건

(1)칼럼 : C18(Xbridge, 2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼 온도 : 40℃

(가) 이동상 A : 0.1 mM 불화암모늄 용액

(나) 이동상 B : 메탄올

시간(분)	A(%)	B(%)
0.00	50	50
4.00	0	100
7.00	0	100
7.01	50	50
10.00	50	50

(3) 이동상 유량: 0.3 mL/분

(4) 주입량: 5 μL

나) 질량분석기 측정조건

(1) 이온화 : ESI positive-ion mode

(2) Capillary temperature : 300℃

(3) Capillary voltage : 3.6 kV (Positive), 2.8 kV (Negative)

(4) Collision gas : 아르곤(Ar)

(5) 분석대상 및 개별 조건(MRM 조건)

분석성분	이온화 (Ionization mode)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온(Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
루바베그론 (Lubabegron)	Positive	499.19	500	215	29
				250	20
				251	25

※밑줄 표시 되어 있는 것은 정량이온이며 그 외 이온들은 정성이온임

※ 각 생성이온(Product ion)에 대한 질량분석기의 기기조건은 사용기기의 최적값으로 변경하여 사용할 수 있으며, 제시된 이외의 생성이온도 적용이 가능함

8) 정성 및 확인시험

가) 정성 및 확인

위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치하여야 한다. 또한 표준용액과 시험용액의 선구이온(Precursor ion) 및 생성이온(Product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(Ion ratio)을 비교하여 그 비율은 주1)과 일치하여야 한다.

주1). 생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율(%)	허용범위
> 50%	≤ 20%
> 20%, ≤ 50%	≤ 25%
> 10%, ≤ 20%	≤ 30%

나) 표준품의 크로마토그램

루바베그론 (3.3분)

그림 1. 루바베그론(0.002 μg/mL)의 크로마토그램

9) 정량시험

가) 정량

정성 및 확인시험과 똑같은 조건에서 Blank 시료를 포함하여 각 농도별 첨가시료에서 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한 후 시험용액의 크로마토그램으로부터 정량이온(Quantitative ion)의 각 피크 높이 또는 피크 면적에따라 산출된 시험용액 중검출농도, 검체량과 최종 시험용액의 부피를 고려하여 정량한다.

나) 정량한계 : 0.0002 mg/kg