9.2.4 파튤린

가. 시험법 적용범위사과주스 및 사과주스 농축액 등

나. 분석원리검체 중의 파튤린을 초산에틸로 추출하고 여기에 무수탄산나트륨(Na2CO3) 용액을 넣어 방해물질을 분리․제거한 후 농축한 것을 초산용액에 녹여 자외선흡광검출기가 부착된 액체크로마토그래프로 분석한다.

다. 장치

1) 액체크로마토그래프 : 자외선흡광검출기(UV photometric detector)를 사용한다.

2) 시험관(Ⅰ) : 마개 달린 유리시험관(20 × 150 mm)

3) 시험관(Ⅱ) : 마개 달린 유리시험관(16 × 150 mm)

4) 시험관(Ⅲ) : 마개 달린 유리시험관(20 × 180 mm)

5) 농축용 시험관(Ⅳ) : 50 mL 용 유리시험관

라. 시약 및 시액

1) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액：파튤린 표준품 5 mg을 달아 초산에틸에 녹인 후 200 μg/mL 농도가 되도록 조제하여 표준원액으로 사용한다. 조제 후에는 알루미늄호일로 싸서 냉동보관하며 사용한다.

4) 표준용액：표준원액을 질소로 건고시킨 후 최종농도가 100, 200, 500, 1,000 ng/mL 되도록 초산용액으로 각각 희석한 것을 검량선 작성을 위한 표준용액으로 사용한다. 조제후에는 알루미늄호일로 싸서 냉장보관하며 사용한다.

5) 5-Hydroxymethylfurfural(HMF) 용액：
5-Hydroxymethylfurfural 5 mg을 달아 초산에틸 25 mL에 녹인 것을 사용한다.

6) 파튤린-HMF 혼합용액：파튤린 표준원액 0.1 mL과 HMF 용액 0.1 mL를 취하여 10 mL 메스플라스크에 넣고 질소로 건고한 후 초산용액을 가하여 10 mL로 한 것을 사용한다.

7) 초산용액：물에 초산을 가하여 pH 4.0으로 조정한다.

8) 1.5% 탄산나트륨 용액：무수탄산나트륨 1.5 g을 증류수에 녹여 100 mL로 만들어 사용한다.

9) 기타시약 : 특급

마. 시험용액의 조제시료 5 g을 정밀히 달아 시험관(Ⅰ)에 취하고 초산에틸 10 mL를 넣어 1분간 심하게 흔들어 섞은 후 정치하여 파스퇴르 피펫으로 상층액을 다른 시험관(Ⅱ)에 옮긴다. 시험관(Ⅰ)에 초산에틸 10 mL를 넣고 1분간 심하게 흔들어 섞은 후 정치하여 상층액을 위의 시험관(Ⅱ)에 합한다. 이 초산에틸 추출액에 1.5% 탄산나트륨 용액 2 mL를 넣고 1분간 심하게 흔들어 섞은 후 정치하여 상층액을 다른 시험관(Ⅲ)에 옮긴다. 시험관(Ⅱ)에 초산에틸 5 mL를 넣고 1분간 심하게 흔들어 섞은 후 정치하여 상층액을 위의 시험관(Ⅲ)에 합한다. 이 초산에틸 추출액에 무수황산나트륨 5 g을 넣고 30초간 심하게 흔들어 섞은 후, 초산에틸 층을 농축용 시험관(Ⅳ)에 옮긴다. 시험관(Ⅲ)에 남은 무수황산나트륨을 5 mL의 초산에틸로 2회 세척하여 시험관(Ⅳ)에 모은 다음 40℃에서 질소 건고한 후 초산에틸 5 mL로 시험관 기벽을 잘 씻은 다음 다시 질소로 건고한다. 잔류물에 초산용액 0.5 mL을 가하여 녹인 것을 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프의 측정조건

가) 칼럼： C18(4.6 mm × 250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상：0.8% 테트라하이드로푸란

다) 검출파장 : UV 276 nm

라) 유속 : 0.5 mL/분

마) 주입량 : 50 μL

바) 시스템 적합성 시험 : 파튤린-HMF 혼합용액을 액체크로마토그래프에 50 μL 주입하였을 때 HMF와 파튤린의 피크가 순차적으로 나오며 그 분리도가 1.5 이상이어야 한다.

2) 검량선 작성
표준용액을 액체크로마토그래프에 주입한 후 얻어진 크로마토그램상의 피크 높이 또는 면적을 이용하여 검량선을 작성한다.

사. 정성시험위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 한다.

아. 정량시험정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험용액의 크로마토그램으로부터 파튤린의 피크높이 또는 피크면적을 검량선에 대입하여 정량한다.

1) 계산

파튤린의 함량(μg/kg) = C × V/S × D

C：검량선에서 구한 파튤린의 농도(ng/mL)

V : 시험용액의 최종부피(mL)

S : 시료 채취량(g)

D : 시험용액의 희석배수