9.7.3 액체크로마토그래피에 의한 시험

가. 시험법의 적용범위

불검출 기준 적용대상 이외의 식품

나. 분석원리

검체 중의 멜라민을 아세토니트릴․물(50:50, v/v) 용액으로 추출하고 이를 양이온교환수지를 사용하여 정제한 후 액체크로마토그래프로 분석한다.

다. 장치

1) 액체크로마토그래프 : 자외부흡수검출기(UV detector)를 사용한다.

2) 정제용 카트리지 : 설폰산기(-SO
3H)를 갖는 강산성 양이온교환수지 카트리지로서 Oasis MCX(150 mg 함유, 6 mL용) 또는 이와 동등한 것

라. 시약 및 시액

1) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액 : 멜라민 표준품 100 mg을 취하여 물에 녹여 정확히 200 mL로 한다.

4) 표준용액 : 표준원액을 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 및 5.0 μg/mL의 농도가 되도록 물에 녹여 희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다.

5) 4% 개미산용액 : 개미산(Formic acid) 4 mL에 물을 가하여 100 mL로 한다.

6) 0.2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 : 디에틸아민(Diethylamine) 0.2 mL에 아세토니트릴을 가하여 100 mL로 한다.

7) 2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 : 디에틸아민 2 mL에 아세토니트릴을 가하여 100 mL로 한다.

8) 기타시약 : 특급

마. 시험용액의 조제

1) 추출

검체를 분쇄한 후 시료 1 g을 정밀히 달아 폴리프로필렌 원심분리관에 넣는다. 여기에 물 5 mL을 넣어 검체를 습윤시킨 후 아세토니트릴 5 mL을 가하여 심하게 흔들어 섞고 30분간 초음파 진탕한 다음 원심분리(2,600 ×G, 10분)한다. 상등액을 취하여 0.45 μm 멤브레인필터로 여과한 것을 추출액으로 한다(상등액의 층이 분리되어 있을 경우 서로 혼화시킨 후 여과한다).

주1) 동물의 근육이나 조직을 분석할 경우에는 검체를 분쇄한 후 시료 5 g을 정밀히 취한 후 물 10 mL를 가하여 습윤시키고 아세토니트릴 10 mL를 가한 후 상기와 같이 초음파 진탕, 원심분리 및 여과한다.

2) 정제

미리 아세토니트릴 5 mL, 4% 개미산용액 5 mL를 차례로 흘려 활성화시킨 정제용 카트리지에 4% 개미산용액 3 mL 및 추출액 2 mL를 함께 주입하고 이를 중력을 이용하여 유출시킨다. 이어서 아세토니트릴 5 mL, 0.2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 5 mL를 차례로 흘린 후 카트리지 내에 남아있는 용액을 감압펌프를 이용하여 제거하고 2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 4 mL로 용출시킨다. 카트리지 내에 남아있는 용액은 감압펌프를 이용하여 완전히 용출시켜 용출액에 합한다*. 용출액 2 mL를 4 mL 바이알(Vial)에 취하여 50℃에서 질소로 건고한 후 잔류물에 물 1 mL를 가하여 녹인 것을 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프의 측정조건

가) 칼럼 : C18(4.6 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상 : 완충용액․아세토니트릴(85:15, v/v)

완충용액 : 무수구연산 1.92 g과 옥탄설폰산나트륨 [C8H17O3SNa] 2.16 g을 950 mL의 물에 녹이고 1 M 수산화나트륨을 사용하여 pH 3.0으로 한 후 물을 가하여 전량을 1 L로 한다.

다) 검출파장 : 240 nm

라) 유속 : 1.0 mL/분

마) 주입량 : 10 μL

2) 검량선 작성

표준용액을 액체크로마토그래프에 주입한 후 얻어진 크로마토그램상의 피크 높이 또는 면적을 이용하여 검량선을 작성한다.

사. 정성시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 한다.

아. 정량시험

정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험용액의 크로마토그램으로부터 멜라민의 피크높이 또는 피크면적을 검량선에 대입하여 정량한다.

1) 계산

멜라민의 함량(mg/kg) = C × V/S × D

C : 검량선에서 구한 멜라민의 농도 (μg/mL)

V : 시험용액의 최종 부피(mL)

S : 시료 채취량(g)

D : 시험용액의 희석배수

자. 확인시험

9.7.2 액체크로마토그래피/질량분석기/질량분석기에 의한 시험사. 정성시험 또는 9.7.4 기체크로마토그래피/질량분석기에 의한 확인시험 사. 정성시험에 따라 시험할 때 멜라민이 확인되어야 한다.