9.8.2 마비성 패독

가. 시험법 적용범위패류, 피낭류, 패류 및 피낭류 통조림, 패류 및 피낭류 염장품, 패류 및 피낭류 건조가공품에 적용한다.

나. 분석원리균질화한 검체를 0.1 N 염산으로 가온 추출한 뒤 상층액을 마우스 복강 내에 주사하여 그 치사시간으로부터 MU(Mouse Unit)*을 구한 후 이를 마비성 패독으로환산한다.

*MU(Mouse Unit): 체중이 20 g인 마우스를15분에사망에 이르게 하는 독량을 1 MU로 정의한다.

다. 장치

1) 정제용 칼럼 : 크로마토그래피용 활성탄(100 mesh) 50 mL를 안지름 20 mm의 유리칼럼에 충전하여 사용하거나 또는 이와 동등한 것을 사용할 수 있다.

2) pH 측정기：표준완충액 pH 4.0, pH 7.0, pH 10.0으로 표준화 시킨 것

라. 시약 및 시액

1) 물 : 2차 증류수 및 이와 동등한 것

2) 표준용액 : 삭시톡신 표준물질에 3.0 mM 염산을 가하여 1 μg/mL 농도가 되도록 조제한다.

3) 1% 초산 함유 20% 에탄올용액 : 1 L 메스플라스크에 에탄올 200 mL를 넣고 물 500 mL를 섞은 후 초산 10 mL를 넣고 표시선까지 물로 채운다.

4) 5 N 염산 : 물 50 mL에 염산 47.5 mL을 가하고 물을 가해 100 mL로 한다

5) 0.1 N 염산 : 5 N 염산을 물로 50배 용량으로 희석하거나 물 50 mL에 염산 0.95 mL을 가하고 물을 가해 100 mL로 한다.

6) 0.01 N 염산 : 0.1 N 염산을 물로 10배 용량으로 희석하거나 물 100 mL에 염산 0.475 mL을 가하고 물을 가해 500 mL로 한다.

7) 3 mM 염산 : 물 50 mL에 0.1 N 염산 3 mL를 가하고 물을 가해 100 mL로 한다.

8) 0.1 N 수산화나트륨용액 : 수산화나트륨 0.40 g을 물을 가하여 녹인후 100 mL로 한다.

9) 기타 시약 : 특급

마. 시험용액의 조제

1) 검체의 손질

가) 패류, 피낭류패류 및 피낭류의 외부를 물로 깨끗이 씻고 10개체 이상 또는 껍질을 제거한 육이 200 g 이상이 되도록 손질 한다.(패류의 경우 패각을열고 내부의 모래나 이물질을 제거하기 위해 물로 씻은 후 칼로 패육을 취한다.) 이때 가열하거나 약품을 사용해서는 아니 된다. 육 전량을 표준체(20 mesh)에 얹어 5분 동안 물을 뺀 후 균질기로 균질화한다.

나) 패류 및 피낭류 통조림내용물 전량을 취해 균질화한다(대용량인 경우 표준체(20 mesh)에 얹어 2분간 고형물과 액체를 분리한 후 고형물과 액체의 중량을 측정하고 그 비율에 따라 200 g 이상을 취하여 균질화한다).

다) 패류 및 피낭류 염장품, 패류 및 피낭류 건조가공품검체 일정량을 분말로 만들거나 가늘게 잘라 균질화한다.

2) 추출

가) 패류, 피낭류, 패류 및 피낭류 통조림균질화한 검체 100 g을 비커에 달아 0.1 N 염산 100 mL를 가하고 교반하면서 5 N 염산이나 0.1 N 수산화나트륨용액으로 pH를 3.0으로 조정한다. 강염기성이 되면 독이 파괴되기 때문에 0.1 N 수산화나트륨용액으로 pH을 조정할 때에는 부분적인 파괴를 방지하기 위하여 격렬히 교반하면서 소량씩 적가한다. 혼합액을 5분간 끓이고 실온에서 식힌 후, pH가 3.0이 되도록 조정하고 물을 가하여 200 mL이 되게 한다. 비커에 옮긴 후 교반하고 상층부가 투명해질 때까지 정치하여 상층액을 시험용액으로 한다. 만약, 필요하면 원심분리(예: 1,200G에서 5분간)하여 얻은 상층액을 시험용액으로 사용하여도 된다.

나) 패류 및 피낭류 염장품, 패류 및 피낭류 건조가공품균질화한 검체 20 g을 비커에 달아 0.1 N 염산 100 mL를 가하여 패류의 추출방법에 따라 추출한다. 추출액 중 상층액 25 mL를 분취하여 pH 4.5～5.5로 조정한 다음 분당 3 mL 이하의 유속으로 정제용 유리칼럼을 통과시킨다. 물 100 mL로 칼럼을 세척한 후 1% 초산함유 20% 에탄올용액 150 mL로 용출시킨다. 용출액을 감압 농축하고 잔류물을 0.01 N 염산 10 mL에 녹여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작(마우스 시험)

1) 마우스
ICR계의 또는 ddy계 동일계통의 생후 4주된 19～21 g의 건강한 수컷을 사용한다. 시험에 사용한 마우스는 표 2를 이용하여 마우스체중에 대해 보정한다.

2) 시험
시험용액 1 mL을 2마리의 마우스 복강 내에 주사하고 주사 후부터 사망까지의 시간을 초단위로 기록한다. 사망 시에는 3마리 이상의 마우스를 취하여 복강 내에 주사하여 치사시간을 구한다. 다만, 마우스가 5분 이내에 사망한 경우 5～7분 정도에서 사망하도록 희석하여 치사시간을 구한다. 희석시에는 0.1 N 또는 0.01 N 염산으로 pH 2.0～4.0 되게 조정하여 사용한다.

사. 계산

1) CF(Conversion Factor) 산출
표준용액 10 mL에 3.0 mM 염산을 10, 15, 20, 25 및 30 mL을 각각 가하여 희석 한 용액(이 액은 pH가 2.0～4.0이어야하며, 4.5를 넘어서는 안된다) 1 mL 씩을 각각 3마리 마우스에 복강 내 주사하고 주사 후부터 사망까지의 시간을 초단위로 기록하여 치사시간이 5～7분 사이가 되는 용액의 농도를 선택한다. 선택된 농도에 첨가되는 3.0 mM 염산의 양을 1 mL씩 증감하여 세 농도의 희석표준용액을 제조한다(표준용액 10 mL에 3.0 mM 염산 25 mL로 희석한 액이 선택된 경우, 표준용액 10 mL에 3.0 mM 염산 24 mL, 25 mL 및 26 mL을 각각 가하여 제조한다) 이 세 농도의 희석표준용액 1 mL 씩을 각각 10마리의 마우스 복강 내에 주사하여 치사시간을 구한다. 표 1에 의한 치사시간에 따른 MU와 표 2에 의한 마우스의 체중에 따른 MU를 곱한 보정된 MU들을 구하고, 이 보정된 MU들의 중앙값을 희석표준용액의 MU로 한다.

CF는 각 희석표준용액의 CF를 평균하여 구한다.

CF	=	희석표준용액의 농도(ug/mL)
		MU

2) CF를 이용한 마비성 패독 계산
시험용액 1 mL를 마우스에 주사하고 살아남은 것을 포함한 각 마우스의 치사시간으로부터 표 1에서 1 mL 당 MU를 구하고, 표 2에서 각 마우스체중에 대한 MU를 보정한 후 중앙값을 구한다(중앙값을 구할 때 60분 이상 살아있는 마우스의 치사시간에 대한 MU는 0.875이하로 간주).

CF에 마우스체중을 보정한 1 mL당 MU의 중앙값을 곱하여 1 mL당 μg의 마비성 패독으로 환산하고 다음 식에 의해 검체 중의 마비성 패독을 구한다.

마비성 패독(mg/kg) = CF × 치사시간 및체중보정에 의한 MU × 최종부피(mL)×희석배수 / 검체량(g)

표 1. 마비성 패독의 치사시간-MU 환산표(Sommer 표)

치사시간 (분:초)	MU	치사시간 (분:초)	MU	치사시간 (분:초)	MU
1:00	100.0	4:00	2.500	5:25	1.770
1:10	66.20	4:05	2.440	5:26	1.764
1:15	38.30	4:10	2.380	5:27	1.758
1:20	26.40	4:15	2.320	5:28	1.752
1:25	20.70	4:20	2.260	5:29	1.746
1:30	16.50	4:25	2.210	5:30	1.740
1:35	13.90	4:30	2.160	5:31	1.735
1:40	11.90	4:35	2.120	5:32	1.730
1:45	10.40	4:40	2.080	5:33	1.725
1:50	9.330	4:45	2.040	5:34	1.720
1:55	8.420	4:50	2.000	5:35	1.715
		4:55	1.960	5:36	1.710
2:00	7.670			5:37	1.705
2:05	7.040	5:00	1.920	5:38	1.700
2:10	6.520	5:01	1.914	5:39	1.695
2:15	6.060	5:02	1.908	5:40	1.690
2:20	5.660	5:03	1.902	5:41	1.686
2:25	5.320	5:04	1.896	5:42	1.682
2:30	5.000	5:05	1.890	5:43	1.678
2:35	4.730	5:06	1.884	5:44	1.674
2:40	4.480	5:07	1.878	5:45	1.670
2:45	4.260	5:08	1.872	5:46	1.664
2:50	4.060	5:09	1.866	5:47	1.658
2:55	3.880	5:10	1.860	5:48	1.652
		5:11	1.854	5:49	1.646
3:00	3.700	5:12	1.848	5:50	1.640
3:05	3.570	5:13	1.842	5:51	1.636
3:10	3.430	5:14	1.836	5:52	1.632
3:15	3.310	5:15	1.830	5:53	1.628
3:20	3.190	5:16	1.824	5:54	1.624
3:25	3.080	5:17	1.818	5:55	1.620
3:30	2.980	5:18	1.812	5:56	1.616
3:35	2.880	5:19	1.806	5:57	1.612
3:40	2.790	5:20	1.800	5:58	1.608
3:45	2.710	5:21	1.794	5:59	1.604
3:50	2.630	5:22	1.788
3:55	2.560	5:23	1.782	6:00	1.600
		5:24	1.776	6:01	1.596
치사시간 (분:초)	MU	치사시간 (분:초)	MU	치사시간 (분:초)	MU
6:02	1.592	6:39	1.450	11:00	1.075
6:03	1.588	6:40	1.447	11:30	1.060
6:04	1.584	6:41	1.443
6:05	1.580	6:42	1.440	12:00	1.050
6:06	1.576	6:43	1.437
6:07	1.572	6:44	1.433	13:00	1.030
6:08	1.568	6:45	1.430
6:09	1.564	6:46	1.427	14:00	1.015
6:10	1.560	6:47	1.425
6:11	1.556	6:48	1.422	15:00	1.000
6:12	1.552	6:49	1.419
6:13	1.548	6:50	1.417	16:00	0.990
6:14	1.544	6:51	1.414
6:15	1.540	6:52	1.411	17:00	0.980
6:16	1.536	6:53	1.409
6:17	1.532	6:54	1.406	18:00	0.972
6:18	1.528	6:55	1.403
6:19	1.524	6:56	1.401	19:00	0.965
6:20	1.520	6:57	1.398
6:21	1.516	6:58	1.395	20:00	0.960
6:22	1.512	6:59	1.393
6:23	1.508			21:00	0.954
6:24	1.504	7:00	1.390
6:25	1.500	7:15	1.350	22:00	0.948
6:26	1.496	7:30	1.310
6:27	1.492	7:45	1.280	23:00	0.942
6:28	1.488
6:29	1.484	8:00	1.250	24:00	0.937
6:30	1.480	8:15	1.220
6:31	1.477	8:30	1.200	25:00	0.934
6:32	1.473	8:45	1.180
6:33	1.470			30:00	0.917
6:34	1.467	9:00	1.160
6:35	1.463	9:30	1.130	40:00	0.898
6:36	1.460
6:37	1.457	10:00	1.110	60:00	0.875
6:38	1.453	10:30	1.090

표 2. 마우스체중-MU 보정표

마우스 체중(g)	MU	마우스 체중(g)	MU
10.00	0.500	19.10	0.973
11.00	0.560	19.20	0.976
12.00	0.620	19.30	0.979
13.00	0.675	19.40	0.982
14.00	0.730	19.50	0.985
14.50	0.760	19.60	0.988
15.00	0.785	19.70	0.991
15.50	0.810	19.80	0.994
16.00	0.840	19.90	0.997
16.50	0.860	20.00	1.000
17.00	0.880	20.10	1.003
17.10	0.885	20.20	1.006
17.20	0.890	20.30	1.009
17.30	0.895	20.40	1.012
17.40	0.900	20.50	1.015
17.50	0.905	20.60	1.018
17.60	0.910	20.70	1.021
17.70	0.915	20.80	1.024
17.80	0.920	20.90	1.027
17.90	0.925	21.00	1.030
18.00	0.930	21.10	1.032
18.10	0.934	21.20	1.034
18.20	0.938	21.30	1.036
18.30	0.942	21.40	1.038
18.40	0.946	21.50	1.040
18.50	0.950	21.60	1.042
18.60	0.954	21.70	1.044
18.70	0.958	21.80	1.046
18.80	0.962	21.90	1.048
18.90	0.966	22.00	1.050
19.00	0.970	23.00	1.070

주1) 마비성 패독이 함유된 재료를 조작시에는 고무장갑을 사용할 것