9.8.3 설사성 패독

가. 시험법 적용범위 : 이매패류

나. 분석원리이매패류의 패육을 취하여 균질화한 후 90% 메탄올로 추출하여 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기로 분석한다.

다. 장치

1) 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기

2) 막 여과지(membrane filter) : 0.45 μm 또는 이와 동등한 것

라. 시약 및 시액

1) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액 : Okadaic acid (OA)와 Dinophysistoxin-1 (DTX-1) 표준품을 정밀히 달아 메탄올로 용해하여 50 μg/mL이 되도록 한다. 표준원액은 영하 20℃ 이하에서 보관한다.

4) 표준용액 : 표준원액을 0.005, 0.010, 0.020, 0.050 및 0.100 μg/mL 농도가 되도록 90% 메탄올로 희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다(사용 시 조제한다).

5) 이동상 원액 : 90% 개미산 (Formic acid; HCOOH) 12.79 g (96% 개미산은 11.99 g, 98% 개미산은 11.74 g)과 개미산암모늄(Ammonium formate; NH
4COOH) 0.63 g을 250 mL 용량플라스크에 취하여 100 mL의 물로 용해하고 암모니아수를 이용하여 pH 2.3으로 조절한 후 물로 표시선까지 채운다.

6) 추출용액 : 90% 메탄올(v/v)

마. 시험용액의 조제

1) 검체의 채취
검체는 폴리에틸렌 용기에 넣고 10℃ 이하로 유지하여 신속하게 운반한다. 단, 껍데기를 제거한 패육이 100 g 이상이 되도록 채취하여야 한다.

2) 시료 조제
물로 패류의 외부를 깨끗이 씻은 후 껍데기를 제거하고, 내부의 모래나 이물질을 제거하기 위해 물로 씻은 후 칼로 패육을 취한다. 이때 가열하거나 약품을 사용해서는 아니 된다. 패육 100～150 g의 시료를 표준체(20 mesh)에 얹어 5분 동안 물을 뺀 후 균질기로 균질화한다.

3) 추출
균질화한 시료 1 g을 비커에 달아 90% 메탄올 9 mL를 가하고 교반기를 이용하여 3분 동안 추출한다. 추출액을 15 mL 원심분리관에 넣고 90% 메탄올로 10 mL 눈금에 맞춘 후 원심분리(1,000 × G,5분)한다. 상등액 중 2 mL를 막 여과지(membrane filter)를 이용하여 여과한 것을 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프의 측정조건

가) 칼럼 : C18(2.0 × 150 mm,5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상은 A 및 B 용액의 농도 구배조건에 따라 사용한다

이동상 A : 증류수․이동상원액(95:5, v/v)

이동상 B : 95% 아세토니트릴․이동상원액(95:5, v/v)

시간(분)	A (%)	B (%)
0.0	80	20
10.0	0	100
15.0	0	100
17.0	80	20
20.0	80	20

다) 유속 : 0.2 mL/분

라) 주입량 : 5 μL

마) 칼럼온도 : 35℃

2)질량분석기/질량분석기의 조건

가) Ionization : ESI(Negative)

나)Source voltage : - 4.0 kV

다) Gas : 헬륨 또는 질소

라) Capillary Temperature : 300℃

3) 검량선 작성
표준용액을 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기에 주입한 후 얻어진 크로마토그램 상의 특성이온의 피크 높이 또는 면적을 이용하여 검량선을 작성한다.

4) 정성시험
위의 조건으로 얻어진 시험용액 크로마토그램상의 특성이온 피크는 표준용액 특성이온 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치 여부를 확인한다.

물질	Precursor ion (m/z)	Fragment ion(m/z)
OA	804	255
DTX-1	818	255

5) 정량시험
정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험용액 특성이온의 피크높이 또는 피크면적을 검량선에 대입하여 설사성 패독의 함량을 정량한다.

사. 계산

설사성 패독의 함량(μg/g) = (COA+ CDTX-1) × V/S

COA: 검량선에서 구한 Okadaic acid의 농도(μg/mL)

CDTX-1: 검량선에서 구한 Dinophysistoxin-1의 농도(μg/mL)

V : 시험용액의 최종부피(mL)

S : 시료의 채취량(g)