9.11 그레이아노톡신(Grayanotoxin) Ⅲ

가. 시험법 적용범위그레이아노톡신 함유여부를 확인하기 위해 식품 중 벌꿀에 적용한다.

나. 분석원리

벌꿀 검체를 메탄올에 녹여 고체상추출카트리지로 정제후 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기를 이용하여 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기(LC/MS/MS)를 사용한다.

라. 시약 및 시액

1) 용매：액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물：액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액：Grayanotoxin III hemi (ethyl acetate)의 표준품을 메탄올에 녹여 1000 μg/mL로 조제하여 표준원액으로 하고 냉장 저장한다.

4) 표준용액 :　표준원액을 0.020,0.050, 0.100, 0.250, 0.500 ㎍/㎖의 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 사용한다.

5) 기타시약：특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액의 조제검체 10 g을 메탄올에 녹여 50 mL의 메스플라스크로 옮겨 눈금까지 메탄올로 채운 후, 이 액 25㎖를 취하여 5 mL의 메탄올을 미리 통과시킨 후 증류수로 세척한 C18카트리지에 주입하고 3 mL의 메탄올로 용출시킨다. 용출액을 증류수와 1:1 희석하여 시험용액으로 사용한다. 벌집 속에 있는 벌꿀은 스테인리스체(850 μm)에서 벌꿀을 분리하여 10 g을 채취한 후 동일한 방법으로 시린지필터(0.2㎛)로 여과한 것을 시험용액으로 한다

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기(LC/MS/MS)의 측정조건

가) 칼럼：Capcell PAK C18(1.5×150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상： A - 1% 개미산(Formic acid) 수용액

B - 1% 개미산을 포함한 메탄올

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	80	20
2.0	10	90
5.0	10	90
8.0	80	20
12.0	80	20

다) 유속：170 μL/min

라) 칼럼온도：38℃

마) 주입량：10 μL

바) 이온화 방식：Electrospray ionization (ESI, positive)

사) Sheath gas：질소

아) Capillary temperature：300℃

자) Auxiliary gas：질소

차) Collision gas：아르곤

카) Spray voltage：4500 eV

타) Selected reaction monitoring(SRM)：m/z 335 → m/z 299

2) 검량선의 작성
표준용액의 농도별로 액체크로마토그래프/질량분석기/질량분석기에 주입한후 얻어진 크로마토그램상의 특성이온(m/z 299)의 피크면적을 이용하여 검량선을 작성한다.

3) 정량(검출)한계 : 25㎍/㎏

사. 정성시험위의 조건으로 얻어진 시험용액 크로마토그램상의 특성이온(m/z 299) 피크는 표준용액 특성이온(m/z 299) 피크의 머무름 시간과 일치하여야한다

아. 정량시험

정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험용액의 크로마토그램으로부터 특성이온(m/z 299) 의 피크면적을 검량선에 대입하여 정량한다.

1) 계산

그레이아노톡신Ⅲ의 함량 (㎍/g) = C×V/S×D

C : 검량선에서 구한 그레이아노톡신의 농도(㎍/㎖)

V ; 시험용액의 최종부피(㎖)

S ; 검체 채취량(g)

D : 희석배수