10.1.14 미승인 유전자변형 밀

밀 또는 그 가공식품에 대하여 PCR 또는 실시간 PCR 장치를 사용하여 제초제 내성 미승인 유전자변형 밀을 검출하기 위한 정성분석방법이다.

가. DNA의 추출

10.1.3 DNA의 추출․정제법에 따라 2회 반복 추출하여 얻은 DNA 용액을 사용한다.

나. 시약 및 시액

1) 프라이머와 프로브(probe)

미승인 유전자변형 밀 검출에 사용하는 프라이머와 프로브(probe)는 표 22와 같으며, 이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 프라이머와 프로브(probe)를 사용할 수도 있다.

2) 반응액의 조제

표 22의 프라이머와 프로브(probe)를 사용하면서 PCR 반응액의 총량을 25μL로 할 경우 PCR 반응액 조성은 표 23〜25와 같다. 다만, PCR 반응액 조성은 프라이머와 프로브(probe) 또는 PCR 기기에 따라 다를 수 있으므로 시약이나 기기의 사용 매뉴얼을 참고하여 적용한다.

목 적	이벤트 (증폭산물크기)	프라이머/ 프로브	염기서열	농도 (nM)
내 재 성 유 전 자	밀 (102 bp)	WACC-KF WACC-KR	5'-GGA GGC ATG CTT CGC TGT CT-3' 5'-CTG CTG CCA TTC CAT TGT TC-3'	400 400
	(94 bp)	WACC-Rf WACC-KR WACC-p	5'-GCT TCG CTG TCT AAG GTT GT-3' 5'-CTG CTG CCA TTC CAT TGT TC-3' 5'-FAM-CGG CAA AAC ACC AAT TCA CA-TAMRA-3'	500 500 300
구 조 유 전 자	M71800 (156 bp)	M71800-KF M71800-KR	5'-CTC CGA TGA AGT GTG AGT AG-3' 5'-CCC CAT TTG GAC GTG AAT GT-3'	400 400
	(90 bp)	M71800-Rf M71800-Rr M71800-p	5'-CTT CTC TCT CTT TGA ATC TCA ATA C-3' 5'-CCA TTT GGA CGT GAA TGT AGA CAC-3' 5'-FAM-CCC TCT CTA ATT CGG AAA TC-TAMRA-3'	500 500 500

성 분	최종 농도(well)	1회 분량(μL)
Gold Taq polymerase(5 U/μL)	0.5U	0.1
PCR Buffer(10X)	1X	2.5
MgCl2(25mM)	1.5 mM	1.5
dNTPs(2.5mM)	200 μM	2.0
프라이머(각 25 μM)	각 400 nM	각 0.4
주형 DNA(20 ng/μL)	50 ng	2.5
멸균증류수	반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가	15.6
전체량		25

성 분	최종 농도(well)	1회 분량(μL)
Universal Master Mix(2 X)	1 X	12.5
프라이머(각 25 μM)	각 500 nM	각 0.5
프로브(10 μM)	300 nM	0.75
주형 DNA(20 ng/μL)	50 ng	2.5
멸균증류수	반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가	8.25
전체량		25

성 분	최종 농도(well)	1회 분량(μL)
Universal Master Mix(2 X)	1 X	12.5
프라이머(각 25 μM)	각 500 nM	각 0.5
프로브(10 μM)	500 nM	1.25
주형 DNA(20 ng/μL)	50 ng	2.5
멸균증류수	반응 총액이 25 μL가 되도록 첨가	7.75
전체량		25

다. 시험 조작

미승인 유전자변형 밀 검사를 위한 PCR 반응조건은 표 26∼27과 같다.

	온도	시간	cycle 수
초기변성 (Initial denaturation)	95℃	5분	1 cycle
변성(denaturation) 결합(annealing) 신장(extension)	95℃ 59℃ 72℃	30초 30초 30초	40 cycles
최종신장 (elongation)	72℃	7분	1 cycle

	온도	시간	결과수집	cycle 수
전 반응 (Pre-PCR incubation)	50℃	2분	No	1 cycle
초기 변성 (Initial denaturation)	95℃	10분	No	1 cycle
증폭 (Amplification)	95℃	15초	No	45 cycles
	59℃	1분	Yes

라. 분석결과의 판정

1) PCR에 따른 결과의 판정

10.1.5 정성시험 마. 전기영동에 따른 결과의 판정에 따라 아가로스겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아마이드겔(polyacrylamide gel)을 이용한 전기영동 등으로 PCR 증폭 결과를 확인하며, 바. 분석 결과의 판정 및 처리에 따라 결과를 판정한다.2회 반복 추출 DNA에 대한 PCR 결과, 하나 이상의 추출 DNA에서 확인시험에 의해 내재성유전자와 도입된 재조합유전자 특이 증폭산물이 모두 확인된 경우 ‘미승인 유전자변형 밀 검출’로 판정하고, 2회 반복 추출 DNA에 대하여 내재성유전자의 증폭산물은 모두 확인되나 도입유전자 특이 증폭산물이 확인되지 않은 경우에는 ‘불검출’로 판정한다.다만, 2회 반복 추출 DNA에서 모두 내재성유전자의 증폭산물이 확인되지 않은 경우에는 DNA 추출 과정부터 다시 반복시험하고, 반복시험 후에도 동일하게 내재성유전자의 증폭산물이 확인되지 않는 경우 ‘검사불능’으로 판정한다.

2) 실시간 PCR에 따른 결과의 판정

10.1.11 유전자재조합 면화 라. 분석결과의 판정에 따르며, 추출 DNA 시료액 별로 3 반복 시험한 결과, 2개 이상의 웰(well)에서 Ct 값이 45 미만이면서 지수함수적인 증폭이 확인되는 경우 해당 DNA 시료액이 양성이라고 판정한다.