10.2.1 유전자코메트 분석법(스크리닝검사법)

가. 시험법 적용범위

냉동 및 냉장 식육(우육, 돈육, 계육)에 적용한다.

나. 분석원리

이온화 조사처리는 세포의 유전자에 손상을 일으키며 이러한 유전자의 손상된 정도를 단일세포의 마이크로젤 전기영동법을 이용하여 코메트 세포를 측정함으로써 조사처리 여부를 검지하는 방법이다.

다. 장치 및 기구

1) 형광항체현미경(FITC Filter 494nm)

2) 전기영동장치

3) 코메트슬라이드

라. 시약 및 시액

1) 20 mM EDTA-PBS

2) Trypan blue stain

3) Low Melting Point Agarose

4) Lysis Solution : 2.5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris base, 1% sodium lauryl sarcosinate, 0.01% TritonX-100, 10% Dimethyl Sulfoxide

5) TBE Buffer : 90 mM Tris-borate, 3 mM EDTA, pH 8.5

6) TE Buffer : 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5

7) SYBR Green 형광염색액

마. 검체조제

1) 시료의 표층부분을 제거한 후, 예리한 메스날 등을 사용하여 육중심부의 근육조직을 얇게 잘라내어 약 1 g 정도 채취하고 이를 교차하면서 잘게 세절 하여 다진 다음 냉장된 20 mM EDTA-PBS에 1:10의 비율(w/v)로 부드럽게 혼합한다.

2) 이를 200 ㎛ 및 100 ㎛ 나일론 여과포로 2회 여과한 다음 trypan blue stain(0.4%)용액 으로 염색하여 살아 있는 세포수를 계산하고 냉장 PBS로 약 10
5cell/mL이 되도록 세포수를 조정한다.

바. 시험조작

1) 세포 부유액을 42℃로 유지된 0.5% Low Melting Point Agarose와 약 1:10(v/v) 비율로 혼합한 즉시 약 50 μL를 채취하여 신속하게 코메트슬라이드에 고르게 펴고 약 5℃ 냉암소에서 10분간 경화한다.

2) 이를 약 5℃ 냉암소에서 세포용해액(Lysis Solution)에 완전히 침지된 상태로 약 28분 동안 반응시킨다.

3) 코메트슬라이드와 경화된 agar 주변의 세포용해액을 흡수지로 신속하게 제거한 후, TBE Buffer(pH 8.5)에 완전히 침지하여 약 5분 동안 2회 반복하여 완충시킨다.

4) 즉시 코메트슬라이드를 TBE Buffer(pH 8.5)로 채워진 전기영동조에 넣어 완전히 침지시킨 상태에서 전압 1 V/㎝(예: 27㎝ 길이의 전기영동조의 경우 전압은 약 27V, 전류는 약 28 mA) 조건으로 19분 동안 전기영동 시킨다.

5) 전기영동 후 즉시 코메트슬라이드 위에 미리 준비한 형광염색용액 두 세 방울을 떨어뜨려 형광염색한다. 형광염색용액은 SYBR Green을 DMSO로 약 10배 희석하여 냉동(－20℃ 이하)보관하고 이를 사용 할 때에 TE Buffer로 희석 (1:1000, v/v)하여 사용한다.

사. 판정

1) 형광항체현미경(FITC Filter 494 nm) 100배에서 200배 확대 비율로 전체적인 코메트세포의 형태를 관찰하여 조사처리 여부를 일차적으로 판단한다(그림 1.).

가) 코메트세포(comet cell)의 형태가 원형 또는 난원형을 띠면서 comet tail 현상이 전체적으로 일정하게 나타나는 경우 조사처리된 것으로 판단한다.

나) 코메트세포(comet cell)의 형태가 원형 또는 난원형을 띠면서 코메트꼬리 (comet tail) 현상이 거의 나타나지 않는 경우 조사처리 되지 않은 것으로 판단한다.

그림 1. 비조사 육류(좌)와 조사된 육류(우)의 코메트세포(형광항체현미경 200배)

2) 1)의 가)과 같이 조사처리된 것으로 판단된 시료에 대해서는, 형광항체 현미경 200배에서 눈금자(1 ㎝ 길이, 눈금단위 10 ㎛)가 있는 대안렌즈를 사용하여 코메트슬라이드의 중앙부분에 위치한 comet cell(시료 하나에 75개 이상)의 Comet head 직경과 Comet tail(comet head 중간 부분에서 comet tail 끝 부분까지의 길이)의 길이를 신속하게 측정한 다음, comet tail의 길이에 대한 comet head 직경의 비율을 계산하여 다음의 기준에 따라 조사처리 여부를 판정한다(표 1.).

가) 1)의 가)에 해당되고 comet head의 직경에 대한 comet tail 길이의 비율이 육류 별로 1 kGy 조사 시료의 평균치 이상인 경우에는 양성으로 판정하고, 전자스핀공명법이나 기체크로마토그래프/질량분석법을 적용하여 조사처리 여부를 최종 판정한다.

나) 1)의 나)에 해당되고 comet head의 직경에 대한 comet tail 길이의 비율이 육류 별로 비 조사 시료의 평균치 이내인 경우(음성), 조사처리 되지 않은 것으로 판정한다.

다) 부분적인 comet tail 현상이 나타나고 comet head 직경에 대한 comet tail 길이의 비율이 육류 별로 비조사처리 시료의 평균치 이상에서 1 kGy 조사된 시료의 평균치 이하의 범위에 해당되는 경우 의양성으로 판정하고, 재 실험을 실시하여 다시 의양성으로 판정되는 경우에는 조사처리 되지 않은 것으로 판정한다.

표 1. 조사처리 육류의 코메트 세포 측정 및 흡수선량 평가 결과

선량(kGy)		코메트세포 (μm)					코메트꼬리/ 코메트머리	선량평가(%)	검지정확도(%)
		코메트머리 (직경)	코메트꼬리 (길이)		전체 길이			정확히 평가된 시료 수 / 시료 수(%)	정확히 검지된 시료 수 / 시료 수(%)
0	FC1	3.91 ± 0.91		2.63 ± 0.52		4.58 ± 0.73	0.71 ± 0.20	10 / 10 (100.0)	10 / 10 (100.0)
	CC2	3.94 ± 0.88		2.55 ± 0.51		4.52 ± 0.74	0.67 ± 0.18	10 / 10 (100.0)	10 / 10 (100.0)
	FP3	4.0 ± 0.88		2.62 ± 0.52		4.62 ± 0.73	0.68 ± 0.19	10 / 10 (100.0)	10 / 10 (100.0)
	CP4	4.07 ± 0.90		2.57 ± 0.53		4.60 ± 0.18	0.66 ± 0.18	10 / 10 (100.0)	10 / 10 (100.0)
	FGP5	4.04 ± 0.87		2.67 ± 0.57		4.69 ± 0.78	0.69 ± 0.19	9 / 10 ( 90.0)	9 / 10 (90.0)
	FB6	4.07 ± 0.88		2.63 ± 0.54		4.66 ± 0.76	0.67 ± 0.19	10 / 10 (100.0)	10 / 10 (100.0)
	CB7	3.96 ± 0.89		2.56 ± 0.52		4.54 ± 0.76	0.67 ± 0.18	10 / 10 (100.0)	10 / 10 (100.0)
	FGB8	4.01 ± 0.88		2.61 ± 0.52		4.62 ± 0.74	0.68 ± 0.18	9 / 10 ( 90.0)	9 / 10 ( 90.0)
1	FC	3.35 ± 0.72		4.88 ± 1.60		6.54 ± 1.77	1.47 ± 0.42	10 / 10 (100.0)	10 / 10 (100.0)
	CC	3.29 ± 0.39		4.73 ± 1.12		6.36 ± 1.21	1.45 ± 0.32	10 / 10 (100.0)	10 / 10 (100.0)
	FP	3.37 ± 0.72		4.94 ± 1.64		6.62 ± 1.81	1.49 ± 0.44	10 / 10 (100.0)	10 / 10 (100.0)
	CP	3.31 ± 0.38		4.76 ± 1.12		6.39 ± 1.21	1.45 ± 0.31	9 / 9 (100.0)	10 / 10 (100.0)
	FGP	3.39 ± 0.71		4.50 ± 1.62		6.66 ± 1.79	1.49 ± 0.44	10 / 10 (100.0)	10 / 10 (100.0)
	FB	3.42 ± 0.68		4.97 ± 1.74		6.67 ± 1.87	1.47 ± 0.48	10 / 10 (100.0)	10 / 10 (100.0)
	CB	3.26 ± 0.37		4.72 ± 1.05		6.33 ± 1.14	1.45 ± 0.30	9 / 9 (100.0)	10 / 10 (100.0)
	FGB	3.44 ± 0.69		5.03 ± 1.71		6.74 ± 1.83	1.48 ± 0.48	9 / 10 (90.0)	10 / 10 (100.0)
3	FC	2.94 ± 0.50		6.55 ± 2.05		8.02 ± 2.18	2.23 ± 0.62	9 / 10 ( 90.0)	10 / 10 (100.0)
	CC	3.19 ± 0.50		7.15 ± 1.90		8.74 ± 2.03	2.26 ± 0.57	9 / 10 ( 90.0)	10 / 10 (100.0)
	FP	2.98 ± 0.50		6.74 ± 2.14		8.23 ± 2.26	2.28 ± 0.67	10 / 10 (100.0)	10 / 10 (100.0)
	CP	3.12 ± 0.50		6.93 ± 1.96		8.49 ± 2.08	2.23 ± 0.58	9 / 9 (100.0)	10 / 10 (100.0)
	FGP	2.97 ± 0.45		6.74 ± 2.08		8.22 ± 2.21	2.29 ± 0.64	9 / 10 (90.0)	10 / 10 (100.0)
	FB	2.93 ± 0.50		6.60 ± 2.12		8.07 ± 2.24	2.26 ± 0.66	10 / 10 (100.0)	10 / 10 (100.0)
	CB	3.03 ± 0.48		6.77 ± 1.92		8.29 ± 2.03	2.25 ± 0.61	9 / 9 (100.0)	10 / 10 (100.0)
	FGB	2.93 ± 0.50		6.80 ± 2.12		8.28 ± 2.24	2.33 ± 0.68	9 / 10 (90.0)	10 / 10 (100.0)
5	FC	2.49 ± 0.56		8.46 ± 1.94		9.58 ± 2.07	3.58 ± 1.23	9 / 10 ( 90.0)	10 / 10 (100.0)
	CC	2.51 ± 0.56		7.79 ± 2,08		8.96 ± 2.18	3.25 ± 1.23	10 / 10 (100.0)	10 / 10 (100.0)
	FP	2.50 ± 0.63		8.56 ± 2.20		9.76 ± 2.20	3.75 ± 1.83	9 / 10 ( 90.0)	10 / 10 (100.0)
	CP	2.48 ± 0.55		7.79 ± 2.08		8.93 ± 2.17	3.28 ± 1.23	9 / 9 ( 100.0)	10 / 10 (100.0)
	FGP	2.48 ± 0.62		8.55 ± 2,20		9.74 ± 2.20	3.77 ± 1.83	10 / 10 (100.0)	10 / 10 (100.0)
	FB	2.44 ± 0.62		8.56 ± 2.23		9.75 ± 2.22	3.84 ± 1.86	10 / 10 (100.0)	10 / 10 (100.0)
	CB	3.14 ± 0.48		7.20 ± 1.87		8.77 ± 1.98	2.31 ± 0.59	10 / 10 (100/0)	10 / 10 (100.0)
	FGB	2.45 ± 0.62		8.59 ± 2.23		9.76 ± 2.22	3.84 ± 1.86	10 /10 (100.0)	10 / 10 (100.0)

FC1: 냉동계육, CC2: 냉장계육, FP3: 냉동돈육, CP4: 냉장돈육, FGP5: 냉동분쇄돈육, FB6: 냉동우육, CB7: 냉장우육, FGB8: 냉동분쇄우육, 각 시료의 코메트세포 측정 평균치 ± 표준편차.(p<0.05), 시료 당 측정된 코메트세포 수(n=300), 전체 시료 수: 320(식육 종류 별 각 각 40개)