10.3.1(제1법)초위성체 마커 이용법

초위성체 마커 이용법은 시중 유통 또는 판매되는 쇠고기의 시료로부터 DNA추출 등의 절차를거쳐 그간 개발된 한우 판별 DNA 마커를 사용하여 한우와 비한우(식품의약품 안전처 고시‘식육의 부위별･등급별 및 종류별 구분방법’에 근거한 국내산 육우 및 젖소, 수입산을 포함한다. 이하 같다)를 판별하는 방법으로서 소의 염색체에 존재하는 초위성체(microsatellite, MS) 좌위에서 발생하는 빈도를 한우와 비한우 시료에서 개별적으로 측정하여 차이를 보이는 초위성체 마커를 선별하고 이들의 최적 마커조합을 구성하여 한우와 비한우를 판별한다. 최종 선별된 초위성체 마커 45종에 대한 개별 시료의 유전자형을 알아내고, Reference genotype DB를 기준으로 개체별 유전자형값을 분석하여 한우와 비한우를 구분한다.

가. 시료채취법

시료채취는 제7. 검체의 채취 및 취급방법을 기본원칙으로 하고, 도축검사증명서, 축산물[소]등급판정확인서, 거래명세표 등의 관련 서류 사본(원본대조필)을 확보하여 제공될 수 있어야 하며, 식품의약품안전처 고시 ‘식육의 부위별･등급별 및 종류별 구분방법’에 근거하여 쇠고기의 종류를 채취 용기에 기입한다.

1) 검정방법

※ 한우판별에 대한 검정방법은 45종 초위성체(microsatellite) 마커를 이용한다.

가) 쇠고기 등의 시료에서 DNA 추출

시중에 통상적으로 판매되는 어떠한 Genomic DNA추출키트도 가능하며, 시료간 오염, 이물질의 유입 등이 없는 한 각 검사기관에서 자체적 개발(또는 모방)한 추출방법도 가능하다.

나) DNA 농도측정

일반적 DNA농도측정기, 아가로즈겔 전기영동을 이용하는 방법, DNA정량 측정용 시약 등의 방법으로 농도 및 순도를 측정하여야 하며, 최종 DNA농도는 20～25 ng/μL이 되도록 희석한다.

다) DNA시료의 검정 및 결과판정

45종의 초위성체 (microsatellite) 마커를 이용하여 검정을 실시하고 최종결과를 판정한다. 그 방법은 다음과 같다.

(1) Mutiplex-PCR 반응 조건

시료에서 채취한 Genomic DNA 2 μL(25～50 ng), PCR primer mix 8.25 μL, 10× Reaction Buffer 1.5 μL, dNTPs 1.2 μL, MgCl21.1 μL, Taq DNA polymerase 0.4 μL(1～2U), DMSO 0.25 μL 그리고 3차 증류수 0.3 μL를 첨가하여 15 μL로 primer mix 3개(SET0, SET1, SET2)를 각각 반응한다.

SET	No.	Fluorescent-labled dye	MS marker	5'-Forward-3'	5'-Reverse-3'
SET 0	1	B(FAM)	TGLA227	CGAATTCCAAATCTGTTAATTTGCT	GTTTCTACAGACAGAAACTCAATGAAAGCA
	2		BM2113	GCTGCCTTCTACCAAATACCC	GTTTCTCTTCCTGAGAGAAGCAACACC
	3		TGLA53	GCTTTCAGAAATAGTTTGCATTCA	GTTTCTATCTTCACATGATATTACAGCAGA
	4		ETH10	GTTCAGGACTGGCCCTGCTAACA	GTTTCTCCTCCAGCCCACTTTCTCTTCTC
	5		SPS115	AAAGTGACACAACAGCTTCTCCAG	GTTTCTAACGAGTGTCCTAGTTTGGCTGTG
	6	G(VIC)	TGLA126	CTAATTTAGAATGAGAGAGGCTTCT	GTTTCTTTGGTCTCTATTCTCTGAATATTCC
	7		TGLA122	CCCTCCTCCAGGTAAATCAGC	GTTTCTAATCACATGGCAAATAAGTACATAC
	8		INRA23	GAGTAGAGCTACAAGATAAACTTC	GTTTCTTAACTACAGGGTGTTAGATGAACT
	9	Y(NED)	ETH3	GAACCTGCCTCTCCTGCATTGG	GTTTCTACTCTGCCTGTGGCCAAGTAGG
	10		ETH225	GATCACCTTGCCACTATTTCCT	GTTTCTACATGACAGCCAGCTGCTACT
	11		BM1824	GAGCAAGGTGTTTTTCCAATC	GTTTCTCATTCTCCAACTGCTTCCTTG
	12	R(PET)	CA209	GTAGAAGTTAGTGACTGTCATCC	GTTTCTCCTCAGAGCCCCATACATTTCC
	13		BM3027	CTCAACGGCTTCTTGAATTG	GTTTCTAAGATAAGGCAGAGACCTGGC
	14		BM1862	AAGCAAAAAGGCTGATGGC	GTTTCTTTGCAGATACTGGCAAGTGG
	15		COW_X	AGCTGCTAGACCACATAGAG	GTTTCTCTGTCCTGCTGCTCTGTAAA
	16		COW_Y	AAGAATGGGCGCTTTTCAGC	GTTTCTACCTCTTCCTTGTGCACAGA
SET 1	1	B(FAM)	TGLA325	GGGCACTTTACTCTCTGAACAAATC	GTTTCTGCTGACAGTCTATTTCCAGAAGGTA
	2		CSSM036	GGATAACTCAACCACACGTCTCTG	GTTTCTAAGAAGTACTGGTTGCCAATCGTG
	3		BOVILS95	GAAAGATGTTGCTAGTGGGG	GTTTCTATTCTCCTGTGAACCTCTCC
	4		BM3628	CTGAGATGGACTCAGGGAGG	GTTTCTGTTGGATTGGAAAGGTTAGGC
	5	G(VIC)	BMS2815	TGATATTCAAACTCAATGAACCC	GTTTCTCTTGCATATGCTCATCATTATCA
	6		CSSM041	AATTTCAAAGAACCGTTACACAGC	GTTTCTAAGGGACTTGCAGGGACTAAAACA
	7		BMS1719	GCAGGCAGAATCTTACAGTGG	GTTTCTCAGGCTGGCCTAATTCACAG
	8	Y(NED)	Z27074	CGTGTTGTCTGCCAGGTG	GTTTCTGGAGTGGAGCAGAGTTCTTCC
	9		FASMC2	GAAGATGGGCCCTATAGCTG	GTTTCTAAATGCCACACATTCAAACTC
	10		IDVGA-43	GGGGGGTTGGAAGTATTATCTG	GTTTCTAGAAGGGTCTTGGTCTCCTCACT
	11		IDVGA-7	GGGTGGGCTTCATTTCTATG	GTTTCTCAGCCACTGTCTCCTCCCAC
	12	R(PET)	BMS2270	CTGCGTTAACACCCCACC	GTTTCTGCAGGAAGGCTGATGCAC
	13		BMS65	TCTCAGCAGGAACTCTGGG	GTTTCTAAGAGTCAGACACGGCTTAGTG
	14		INRA081	CGGCTCACGGTCTCTATCGG	GTTTCTGCGAACCCAAGAATCAGACTC
	15		BM741	GCCCCTGAAGGAATGGTG	GTTTCTCCAAAAGGTCCTATCTCCAAA
SET 2	1	B(FAM)	BMS2060	TTGGTAAAGGAGGTATGCAATG	GTTTCTTCCAATTTTAGCCATCTTTGTG
	2		BOVILS21	TCCTGTGGTAAACATAACGG	GTTTCTCAATGCTGTGTTAATTTCTGC
	3		BM3413	TCCCTGGTAACCAATGAATTC	GTTTCTCAATGGATTTGACCCTCCC
	4		ILSTS057	GGAACTGTTCTAAGAAGTGG	GTTTCTTGCTGTTCATTCTATGTGGG
	5	G(VIC)	BMS678	ACCATCTACTGTGCTATGGCTT	GTTTCTGCAGAAACACAATACTCAGTGC
	6		BM1864	TGCCTGAATGAGCCCTCTAC	GTTTCTAGCCTTTGGGTGCAATAGG
	7		MB057	TGTCTGTATTTCTGCTGTGG	GTTTCTACACGGAAGCGATCTAAACG
	8	Y(NED)	BMS2559	ACCTGGGAGAGGACAATGTG	GTTTCTCTCCAACATCGGTCCCAG
	9		BMS1600	TGTGGGAATCTGAAGCTCTATAT	GTTTCTGACATGACTGAGCAACTTTTACC
	10		BL25	AACAGTGGCAATGGAAGTGG	GTTTCTAGTCAGGATCTAGTGGGTGAGTG
	11		BMC6004	GATTCCCTGATAGAAATGGCA	GTTTCTGGTGAGATGAGGATGCGATC
	12	R(PET)	BM713	TGCCTACCTCTTAGGAGTCCA	GTTTCTTCAGACAGAACTGAGGACATGC
	13		BM6418	AAGGTACCAAGAAAGATGGCTG	GTTTCTAACAGATTGGATTTCCCAAGG
	14		IDVGA-39	ACGGTGGGAACATCTTGTCACTA	GTTTCTCCAGTATTCTTCCTGCGAAAAATC

(2) PCR 조건

95℃에서 4분간 denaturation을 실시한 후 94℃에서 60초, 58℃에서 75초, 72℃에서 60초를 1 cycle로 하여 총 5 cycle, 94℃에서 60초, 57℃에서 75초, 72℃에서 60초를 1 cycle로 하여 총 5 cycle, 94℃에서 60초, 56℃에서 75초, 72℃에서 60초를 1 cycle로 하여 총 25 cycle을 반복하는 Touch down PCR 방법을 이용하고, 이후 65℃에서 30분 extension 후 8℃에서 종료한다.

(3) 대립유전자형 분석

PCR 산물을 1 μL 이용하여 분석기관에서 보유한 자동염기서열분석기를 5-color fluorescence labelled dye 시스템(DS-33)에 맞게 설정하고 3차 증류수로 희석한 다음 Formamide와 size marker를 첨가하여 유전자형을 분석한다.

(4) 분석된 대립유전자형 보정

(가) Allelic Ladder를 이용하여 분석기관에서 보유한 자동염기서열분석기로 분석하여 그 결과를 이용해 allelic ladder에 들어있는 대립유전자형 별로 최대, 최소 그리고 평균값을 구하여 이를 대립유전자형 분석 프로그램 (Genotyper, GeneMapper 등)에 적용하여 대립유전자형별 표준 범위를 설정한다.

(나) 표준 범위가 설정된 대립유전자형 분석 프로그램(Genotyper, GeneMaper 등)에 자동염기서열분석기에서 도출된 결과 파일을 이용해 대립유전자형을 표준 데이터로 보정하여 자동염기서열분석기 및 환경적으로 발생하는 오차값을 제거하여 표준데이터 값으로 보정한다. 보정된 데이터는 텍스트파일(*.txt)의 형태로 저장한다.

(5) Microsoft Excel 프로그램을 이용한 유전자형 정리

(가)텍스트파일 형태로 저장된 결과파일을 Microsoft Excel의 외부데이터 가져오기 기능을 사용하여 불러온다. 이때 외부데이터 가져오기 기능에서 “구분기호로 분리됨”을 체크 하고 다음으로 “탭”, “세미콜론”, “공백”을 선택하고 “텍스트 묶음 기호”를 없음으로 설정하여 기존워크시트에 결과파일을 오픈한다.

(나)오픈된 결과 중 Sample name, Marker, Allele 1, Allele 2 값을 제외한 나머지 결과는 삭제 시킨 후 Microsoft Excel 프로그램의 정렬 기능을 이용하여 첫째 기준으로 Marker, 둘째 기준으로 Sample name을 설정 후 정렬한다. 정렬된 결과 값을 Marker별로 가로로 도열될 수 있도록 정리한다.

(6) 판별을 위한 최종판정

(가) 시료의 유전자형이 결정되고 이를 엑셀화일로 정리가 끝나면, 이미 한우 및 비한우로 지정된 개체들의 자료, 즉 대상 집단의 유전자형(Reference genotype DB)과 비교하여 시료의 판정을 결정한다.

(나) (가)의 판별결정을 위해서는 Rannala & Mountain 품종할당방법을 적용한 후 (참조논문: Detecting immigration by using multilocus genotypes. 1997. P.N.A.S. 94: 9197-9201), 해당개체가 두 집단, 즉 한우와 비한우로 할당되는 상대적인 확률값들에 근거하여 확률값이 더 높게 (최소 0.5 이상) 나타나는 집단으로 판정한다.