10.3.2 (제2법) 단일염기다형성 마커 이용법

한우확인 시험법은 한우 판별 마커(marker1))를 사용하여 한우와 비한우(육우, 젖소, 수입산을 포함한다. 이와 같이 한다)를 판별하는 방법이다. 이 방법은 소의 염색체 내에서 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)이 발생하는 빈도를 각각 측정하여 한우와 비한우에서 차이를 보이는 90개의 단일염기다형성 마커를 최적의 마커조합으로 구성하고 각 마커의 유전형에 따른 고유의 판별값을 동시에 측정하여 한우와 비한우를 구분한다.

1)마커(marker)：생명체가 가지고 있는 DNA 염기서열중 특수한 목적으로 선별된 표지 유전자 서열 및 부위

가. 검체의 채취

검체의 채취는 제7. 검체의 채취 및 취급방법을 기본 원칙으로 다음과 같이 한다.

1) 검체 채취와 동시에 음식점의 식육 표시내용(한우, 육우, 젖소, 수입육 등)을 채취용 용기에 기입한다.

2) 채취된 식육 검체가 손상되지 않도록 주의하여야 하고, 미생물의 오염 등이 되지 않도록 주의한다.

3) 검체채취 기구 및 용기

가) 기구 및 용기는 멸균된 일회용 용기를 이용하며 운반시 파손 및 오염의 위험이 없는 것을 사용한다.

나) 검체와 직접 접촉하는 기구 및 용기는 검사결과에 영향을 미치지 않는 것으로 한다.

다) 검체채취 및 기구․용기의 종류

(1) 채취용 기구 : 핀셋, 1회용 칼 등

(2) 채취용 용기․포장 : 검체봉투 등

(3) 소독용구 : 비닐 위생장갑, 알코올, 솜 등

(4) 기 타 : 테이프, 아이스박스, 사진기, 필기구, 아이스팩 등

4) 검체수거 방법

가) 채취자는 일회용 비닐 위생장갑을 착용하고 식육 검체 1점 또는 약 30~50 g (손가락 마디 하나 크기) 정도를 채취하여 즉시 검체봉투에 넣어 봉인한다.

나) 정보 기입시에는 유성펜을 이용하며, 검체명, 검체량, 수거일시, 수거자 등 누구나 알아볼 수 있는 관련 정보를 명시한다.

5) 검체의 운반 요령

가) 채취된 검체는 오염, 파손, 손상, 변형 등이 되지 않도록 주의하여 운반한다.

나) 장거리 운송시 검체는 냉장상태를 유지하면서 운반한다.

다) 멸균용기에 채취하여 24시간 이내에 식품위생검사기관에 운반하여야 하며 부득이한 사정으로 즉시 송부하지 못할 때에는 냉동 보관한다.

라) ‘음식점 식육 원산지 표시제’와 관련된 검체 수거시에는 서류검사와 시험분석을 병용하기 위해 수거 검체에 대한 정확한 정보가 요구되어, 다음 관련 서류 사본을 함께 확보하도록 한다.

주1)음식점영업자 확인서, 등급판정 확인서, 거래명세표, 검사증명서 등의 관련 서류사본

6) 검체의 보관 : 검체가 변질되지 않도록 냉동, 밀폐 보관한다.

나. 판별시험

1) 시험법의 적용 범위
한우(흑우, 제주한우 등의 특수한우 포함), 국내산 육우 및 젖소, 미국산 및 호주산 등의 수입육에 적용한다.

2) 분석원리
한우확인시험법에 사용된 마커는 SNP(단일염기다형성, Single Nucleotide Polymorphism) 마커로서 하나의 SNP는 메이저 대립유전자 동형접합체(major allele homozygote), 이형접합체(heterozygote), 마이너 대립유전자 동형접합체(minor allele homozygote) 등 3종의 유전형을 보인다. 이러한 SNP 마커 가운데 한우와 비한우에서 출현빈도가 서로 다른 마커 90개를 선정하고 각 마커의 유전형을 수치로 변환하여 판별식에 대입함으로서 한우확인시험을 수행한다. 판별식의 결과값이 0.45 이하이면 ‘한우’로, 0.45 보다 크면 ‘비한우’로 판별한다. 시험과정은 대상이 되는 검체의 DNA(핵산)를 추출하여 90개의 SNP 마커의 유전형을 결정한 후 판별식에 대입하여 한우/비한우를 판정하는데 우종별 시험결과는 한우(흑우, 제주한우 등의 특수한우 포함)는 ‘한우’로, 국내산 육우 및 젖소, 미국산 및 호주산 등의 수입육은 ‘비한우’로 판별한다.

3) 장치

가) 대용량 유전자발현 및 변이분석 장치 시스템(Multiplex Genotyping & Gene Expression System), 이하 BeadXpress라 한다.) 또는 이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 것

나) 다표지형광분석장치(Multilabel counter) : 형광램프를 사용한다.

다) 탁상형냉장원심분리기(Bench-top centrifuge) : 96 well plate 전용 로터를 사용한다.

4) 시약 및 시액

가) Nucleic lysis solution : Promega A7943 또는 이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 것

나) 단백질 분해효소 K(20 mg/mL)

다) RNase(4 mg/mL)

라)피코그린 시약 : Molecular probe Cat# P-7581 또는 이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 것

마) Lambda DNA : Invitrogen Cat# 25250-28 또는 이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 것

바) 코브리드 키트(KoBreed Kit) : SNP제네틱스 Cat# VC-2-96 또는 이와 동등한 결과를 얻을 수 있는 것.

5) 시험용액의 조제

가) 핵산 해리 혼합액

Nucleic lysis solution 500μL 당 0.5 M EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid)를 120μL를 첨가해서 조제한다.

나) RNA 분해효소가 첨가된 DNA 재수화(rehydration) 용액

DNA rehydration solution 1 mL 당 RNase(4 ㎎/mL) 10μL를 첨가하여 조제한다.

다) 피코그린 희석 용액피코그린 시약을 TE 완충액(pH 8.0)을 사용하여 1:200으로 희석한다.

라) TE 완충액(pH 8.0)각각의 최종농도가 10 mM Tris-염산용액(pH 8.0), 1 mM EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid) 용액(pH 8.0)이 되도록 멸균증류수를 사용하여 조제한다.

6) 시험조작
한우판별에 대한 시험법은 이 공전에 있는 간이시험방법(대용량 유전형 분석법)으로 시험함을 원칙으로 한다.

가) 소고기 검체에서 DNA 추출

※ 아래의 DNA추출법 이외의 상용화된 Genomic DNA 추출키트도 사용 가능하며, 시료간 오염, 이물질의 유입 등이 없는 한 지정된 검사기관에서 자체적 개발 (또는 모방)한 추출방법도 가능하다.

(1) 0.5 g의 검체를 잘게 다져 1.5 mL 튜브에 옮긴다.

(2) 핵산 해리 혼합액을 300
μL 첨가하고 단백질분해효소 K(20 mg/mL 농도)를 10 μL 첨가한다.

(3) 잘 혼합한 후 검체가 완전히 용해될 때 까지 55℃ 항온수조에 둔다(약 40분～1시간 30분). 이때 10분 간격으로 약 10～20초 간 혼합기를 이용하여 잘 혼합한다.

(4) 얼음 위에 3분 간 둔 뒤 단백질 침전 용액을 100
μL 첨가한 후 20초 간 혼합기를 이용하여 잘 혼합한다.

(5) 얼음 위에 5분 간 둔 뒤 14,000
G에서 5분 간 원심분리한다.

(6) 상층액을 새로운 1.5 mL 튜브에 옮기고 이소프로판올 300
μL를 첨가하여 위 아래로 뒤집으며 잘 섞어준다.

(7) 14,000
G에서 5분 간 원심분리한다.

(8) 상층액을 피펫으로 DNA 응축물이 없어지지 않도록 조심스럽게 버린다.

(9) 70% 에탄올을 1 mL 넣고 2~3번 위 아래로 뒤집으며 잘 섞은 뒤 14,000
G에서 5분 간 원심분리한다.

(10) 상층액을 피펫으로 DNA 응축물이 없어지지 않도록 조심스럽게 버리고 상온에서 DNA 응축물을 건조시킨다(약 5분 간 상온에 방치).

(11) RNA 분해효소가 첨가된 DNA 재수화 용액 50
μL를 가한다.

(12) 튜브 끝을 손가락으로 가볍게 치면서 DNA 응축물을 녹인다.

나) DNA 농도측정

※ 아래의 DNA농도측정 방법 이외에도 일반적 DNA농도측정기, 아가로즈겔 전기 영동을 이용하는 방법, DNA정량측정용 시약 등의 방법으로 농도, 순도를 측정할 수 있다.

(1) 모든 DNA 시료 농도는 피코그린 DNA 정량 용액과 lambda DNA ladder를 이용하여 측정한다.

(2) Lambda DNA 표준액을 만들기 위해 lambda DNA 원액을 각각 0, 1.5262, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 ng/
μL의 농도로 희석한다.

(3) 농도별 lambda DNA 희석 검체 2
μL를 98 μL의 피코그린 희석 용액에 넣고 빛이 없는 곳에서 5분간 상온에서 반응한 후 다표지형광분석장치 (480 nm/520 nm)로 측정한다.

(4) 측정된 값과 희석된 농도값을 기초로 검량선을 작성한다.

(5) DNA 시료는 원액 2
μL를 TE 완충액(pH 8.0)으로 10배 희석하여 위와 같은 방법으로 측정하며 표준곡선을 이용하여 정확한 농도를 산출한다. 이때 DNA의 농도가 100 ng/ μL 이상이거나 1 ng/ μL 이하일 경우 다시 희석하여 재측정한다.

(6) 최종 DNA 농도가 50 ng/
μL이 되도록 TE 완충액(pH 8.0)에 희석한다.

다) 판별 마커의 게노타이핑(genotyping)준비된 DNA 시료(50 ng/μL)는 다음의 과정에 따라 실험한다.

(1) DNA 플레이트(Single-Use DNA Plate) 준비

(가) DNA 플레이트에 5μL의 DNA 플레이트 제조용 시약을 넣고 DNA 시료(50 ng/μL)를 옮겨 넣는다.

(나) 가열 봉합재를 이용하여 DNA 플레이트를 가열기로 봉합하고 95℃로 예열 시켜놓은 가열기에서 30분간 반응시킨다.

(다) 가열 봉합재를 용액이 튀지 않도록 조심스럽게 제거한 후, 5μL의 침전시약을 넣고 용액이 청색으로 변할 때 까지 충분히 혼합한다.

(라) 15μL의 이소프로판올을 넣고 3000G로 20분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 상온에서 15~20분간 말린다.

(마) DNA 플레이트의 각 칸에 10μL의 현탁액(Resuspension solution)을 넣고 청색의 침전물이 완전히 풀어질 때까지 충분히 혼합한다.

(2) 유전형특이연장반응용(Allele-Specific Extension) 플레이트 준비

(가) 유전형특이연장반응용 플레이트 각 칸에 10μL의 올리고풀 시약을 넣고 30μL의 올리고 혼성 접합시약을 추가로 넣는다.

(나) DNA 플레이트의 봉합을 조심스럽게 제거하고 10μL의 DNA 반응액을 유전형특이연장반응용 플레이트로 옮기고 비드(bead)가 완전히 풀어질 때까지 충분히 혼합한다.

(다) 70℃로 예열된 가열기에 유전형특이연장반응용 플레이트를 놓고, 즉시 가열기를 30℃로 맞춘다.30℃로 온도가 떨어질 때까지 놓아둔다.

(3) 연장(Extension) 및 접합(Ligation) 반응

(가) 2분 동안 또는 비드(bead)가 한 곳으로 모일 때까지 자석 플레이트 위에 유전형특이연장반응용 플레이트를 올려놓고, 비드(bead)를 제외한 상층액(~50μL)을 제거하고 50μL의 연장접합반응 혼합용액을 넣는다.

(나) 비드(bead)가 완전히 풀어질 때까지 충분히 혼합한다.

(다) 다시 자석 플레이트 위에 유전형특이연장반응용 플레이트를 2분 동안 올려놓고 비드(bead)를 제외한연장접합반응 혼합용액을 제거한다.

(라) (나), (다)의 과정을 반복한다.

(마) 8-채널 피펫을 사용하여 50μL의 범용완충액을 유전형특이연장반응용 플레이트의 각 칸에 넣고 2분 동안 비드(bead)가 한 곳으로 모일 때까지 자석 플레이트 위에 유전형특이연장반응용 플레이트를 올려놓는다.

(바) 8-채널 피펫을 사용하여 비드(bead)를 제외하고 범용완충액을 제거한다.

(사) (마), (바)의 과정을 반복한다.

(아) 8-채널 피펫을 사용하여 37μL 연장접합반응 효소를 유전형특이연장반응용 플레이트의 각 칸에 넣어주고 플레이트를 접착 필름으로 봉합한 다음 비드(bead)가 풀어지도록 1,600~1,700G으로 비드(bead)가 완전히 풀어질 때까지 1분간 충분히 혼합한다.

(자) 유전형특이연장반응용 플레이트를 45℃로 예열시킨 가열기에서 15분간 반응시킨다.

(4) PCR 반응

(가) PCR 혼합용액 튜브에 64μL의 Titanium Taq DNA 중합효소와 50μL의 Uracil DNA glucosylase를 넣고 충분히 혼합하여 PCR 반응액을 만든 후, PCR 플레이트에 30μL씩 분주한다.

(나) 유전형특이연장반응용 플레이트를 2분 동안 또는 비드(bead)가 한곳으로 몰릴 때까지 자석 플레이트 위에 올려놓고 비드(bead)를 제외한 상층액(~50μL)를 제거한 후 50μL의 범용완충액을 넣어준다.

(다) 다시 비드(bead)가 모일 수 있도록 자석 플레이트 위에 2분 동안 올려놓고 상층액을 모두 제거한 후 자석 플레이트 위에서 유전형특이연장반응용 플레이트를 분리한다. 35μL의 접종용 PCR(Inoculate PCR) 용액을 이 유전형특이연장반응용 플레이트의 각 칸에 넣어주고 플레이트를 봉합한다.

(라) 비드(bead)를 풀어주기 위해 1,800~1,900G으로 1분간 충분히 혼합하고 95℃로 예열시킨 가열기에 1분 동안 반응시킨다.

(마) 가열기에서 플레이트를 꺼낸 뒤 2분 동안 또는 비드(bead)가 모일때까지 자석 플레이트 위에 플레이트를 올려놓은 후 30μL 상층액을 (가)의 PCR 반응액이 담긴 PCR 플레이트로 옮긴다.

(바) PCR 플레이트를 봉합하고 유전자 증폭 장비로 즉시 옮긴다.

(사) 유전자 증폭 장비의 PCR을 다음 그림과 같이 수행한다.

(5) PCR 반응체의 결합 과정

(가) 충분히 혼합된 비드용액(MPB 용액)을 20μL씩 PCR 플레이트로 옮겨 피펫으로 잘 섞은 후 필터 플레이트로 옮긴다.

(나) 커버로 덮고 빛을 차단한 채로 상온에서 60분간 두어 결합이 일어나도록 한다.

(6) VeraCode 비드 플레이트 용 중간 플레이트(Intermediate plate for VeraCode Bead Plate) 준비

(가) 빈 96 칸 규격의폐액 수거용V-bottom 플레이트 위에 필터 플레이트 어댑터를 놓고 그 위에 PCR 반응액이 들어있는 필터 플레이트를 올려놓는다.

(나) 25℃ 에서 1,000G(~2,000G)로 5분 동안 원심분리한다.

(다) 50μL의 범용완충액을 필터 플레이트에 넣고 25℃에서 1,000G(~2,000G)로 5분 동안 원심분리한다.

(라) 별도로 30μL의 혼성용액(Make Hyb 용액)을 새로운 V-bottom 플레이트(중간 플레이트, Intermediate plate)에 분주해 둔다.

(마) (라)의 중간 플레이트 위에 (다)의 필터플레이트를 올린 후 30μL의 0.1 N 수산화나트륨을 필터 플레이트에 분주한다. 이 때 폐액 수거용 V-bottom 플레이트는 제거한다.

(바) 즉시 25℃에서 1000G(~2,000G)로 5분간 원심분리한다. (마)의 필터 플레이트는 버리고, 중간 플레이트는 (7)의 과정이 준비될 때까지 빛을 차단하여 놓아둔다.

(7) VeraCode 비드 플레이트의 혼성 반응(Hybridize VeraCode Bead Plate)

(가) 15 mL 튜브에 3 mL의 혼성용액(Make Hyb 용액)과 3 mL의 0.1 N 수산화나트륨 용액을 넣고 충분히 혼합하여 혼성용액을 중화시킨다.

(나) (가)의 중화된 혼성용액을 (6)의 준비된 중간 플레이트의 각 칸에 50μL씩 분주한 다음 4~5회 피펫으로 섞어준다.

(다) (나)의 반응액 100μL를 VeraCode 비드 플레이트에 옮긴다.

(라) VeraCode 비드 플레이트를 3시간 동안 혼성(850G, 45℃) 시킨다.

(마) VeraCode 비드 플레이트에 200μL의 세척액(VeraCode Wash Buffer)을 피펫을 이용해 천천히 분주한다.

(바) 각 칸 바닥에 비드(bead)가 모이도록 2분 동안 기다린 후 8개 채널 진공펌프(8-channel vaccum manifold)를 이용해 상층액을 제거한다. 진공압력은 약 50 mb로 한다.

(사) (마), (바)의 과정을 반복한다.

(8) VeraCode 비드 플레이트 스캐닝(Scan VeraCode Bead Plate)
반응과정이 끝난 VeraCode 비드 플레이트를 BeadXpress reader로 스캐닝한다. 스캐닝이 완료되면 비드스튜디오 소프트웨어를 이용하여 게노타입을 결정한다.

(9) 최종 게노타입은 키트 내의 설명에 따라 비드스튜디오 소프트웨어의 보고서 형식을 이용하여 파일 형태로 출력한다.

7) 결과판정

가) 최종 게노타입 파일을 표 1의 한우 판별식1)에 의하여 자동 분석하여 판정한다.

1)한우 판별식

SNP별 각각의 게노타입을 표 2와 같이 AA형=0, AB형=1, BB형=2에 해당하는 값을 넣고 한우와 비한우를 각각 0과 2로 판별하는 표 1의 공식에 대입한다. 이때 게노타입에 손실이 있을 경우, 표 2의 해당 값(평균값)을 넣는다.

나) 판별분석에 의한 추정값이 0.45 이하이면 “한우”로 판정하며, 0.45 보다 크면 “비한우”로 판정한다.

SNPID	Genotype 대치값			Missing	SNPID	Genotype 대치값			Missing
Btau00423	CC=0	AC=1	AA=2	0.206	Btau03654	TT=0	TC=1	CC=2	0.870
Btau00498	GG=0	AG=1	AA=2	0.554	Btau03656	GG=0	AG=1	AA=2	0.491
Btau00542	TT=0	TC=1	CC=2	0.811	Btau03717	AA=0	AG=1	GG=2	0.839
Btau00664	AA=0	AG=1	GG=2	0.897	Btau03760	CC=0	TC=1	TT=2	0.427
Btau00673	TT=0	TA=1	AA=2	0.650	Btau03782	CC=0	TC=1	TT=2	0.701
Btau00852	TT=0	TG=1	GG=2	0.659	Btau03807	CC=0	AC=1	AA=2	0.682
Btau00853	CC=0	TC=1	TT=2	0.448	Btau03816	GG=0	AG=1	AA=2	0.487
Btau00926	CC=0	AC=1	AA=2	0.520	Btau03829	GG=0	AG=1	AA=2	0.839
Btau01038	AA=0	AG=1	GG=2	0.977	Btau03845	AA=0	AG=1	GG=2	0.470
Btau01227	TT=0	TC=1	CC=2	0.289	Btau03880	GG=0	AG=1	AA=2	0.509
Btau01397	TT=0	TC=1	CC=2	0.774	Btau03932	TT=0	TC=1	CC=2	0.482
Btau01591	CC=0	TC=1	TT=2	0.858	Btau03989	AA=0	AG=1	GG=2	0.618
Btau01782	GG=0	AG=1	AA=2	0.231	Btau04018	AA=0	AG=1	GG=2	0.397
Btau01804	TT=0	TC=1	CC=2	0.877	Btau04053	CC=0	TC=1	TT=2	0.951
Btau01839	TT=0	TC=1	CC=2	0.745	Btau04080	CC=0	TC=1	TT=2	0.780
Btau02018	GG=0	AG=1	AA=2	0.604	Btau04104	GG=0	AG=1	AA=2	0.557
Btau02057	CC=0	TC=1	TT=2	0.955	Btau04188	GG=0	TG=1	TT=2	0.859
Btau02109	TT=0	TC=1	CC=2	0.797	Btau04200	AA=0	AG=1	GG=2	0.750
Btau02133	AA=0	AG=1	GG=2	0.674	Btau04236	CC=0	GC=1	GG=2	0.748
Btau02265	CC=0	GC=1	GG=2	0.429	Btau04242	CC=0	TC=1	TT=2	0.919
Btau02266	TT=0	TG=1	GG=2	0.933	Btau04312	CC=0	GC=1	GG=2	0.986
Btau02349	CC=0	TC=1	TT=2	0.647	Btau04361	CC=0	TC=1	TT=2	0.922
Btau02443	GG=0	AG=1	AA=2	0.829	Btau04377	TT=0	TC=1	CC=2	0.927
Btau03016	CC=0	TC=1	TT=2	0.744	Btau04394	CC=0	AC=1	AA=2	0.918
Btau03062	CC=0	TC=1	TT=2	0.717	Btau04443	GG=0	AG=1	AA=2	0.996
Btau03108	AA=0	AG=1	GG=2	0.727	Btau04477	GG=0	AG=1	AA=2	0.364
Btau03113	TT=0	TC=1	CC=2	0.966	Btau04480	CC=0	AC=1	AA=2	0.461
Btau03217	CC=0	AC=1	AA=2	0.834	Btau04517	CC=0	TC=1	TT=2	0.361
Btau03224	GG=0	AG=1	AA=2	0.492	Btau04568	CC=0	GC=1	GG=2	0.422
Btau03234	TT=0	TC=1	CC=2	0.872	Btau04630	TT=0	TG=1	GG=2	0.855
Btau03256	CC=0	TC=1	TT=2	0.770	Btau04634	AA=0	AG=1	GG=2	0.824
Btau03281	GG=0	AG=1	AA=2	0.905	Btau04787	GG=0	AG=1	AA=2	0.956
Btau03290	GG=0	AG=1	AA=2	0.776	Btau04808	GG=0	AG=1	AA=2	0.514
Btau03315	TT=0	TC=1	CC=2	0.949	Btau04942	TT=0	TC=1	CC=2	0.357
Btau03318	TT=0	TC=1	CC=2	0.892	Btau05141	TT=0	TC=1	CC=2	0.760
Btau03324	GG=0	AG=1	AA=2	0.832	Btau05398	CC=0	TC=1	TT=2	0.299
Btau03334	TT=0	TA=1	AA=2	0.294	Btau05450	CC=0	TC=1	TT=2	0.855
Btau03344	CC=0	GC=1	GG=2	0.637	Btau05468	AA=0	AG=1	GG=2	0.487
Btau03413	GG=0	AG=1	AA=2	0.846	Btau05555	TT=0	TA=1	AA=2	0.930
Btau03478	CC=0	TC=1	TT=2	0.800	Btau05565	TT=0	TG=1	GG=2	0.899
Btau03480	TT=0	TG=1	GG=2	0.724	Btau05594	TT=0	TG=1	GG=2	0.959
Btau03514	GG=0	AG=1	AA=2	0.494	Btau05638	TT=0	TC=1	CC=2	0.973
Btau03567	TT=0	TC=1	CC=2	0.629	Btau05673	CC=0	TC=1	TT=2	0.823
Btau03572	GG=0	AG=1	AA=2	0.532	Btau05707	CC=0	AC=1	AA=2	0.960
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추정값=0.43173+Btau00423×0.05745+Btau00498×-0.028+Btau00542×0.0411+Btau00664×0.03129+Btau00673×-0.0238+Btau00852×-0.01983+Btau00853×0.03919+Btau00926×0.02612+Btau01038×-0.03568+Btau01227×0.04431+Btau01397×0.01901+Btau01591×-0.01982+Btau01782×0.04025+Btau01804×0.03447+Btau01839×-0.01368+Btau02018×0.02279+Btau02057×-0.0214+Btau02109×0.02794+Btau02133×0.02246+Btau02265×0.02581+Btau02266×0.01842+Btau02349×0.03547+Btau02443×0.02833+Btau03016×-0.05403+Btau03062×-0.02018+Btau0310×0.01546+Btau03113×0.02237+Btau03217×0.03226+Btau03224×-0.03024+Btau03234×-0.02746+Btau03256×0.02839+Btau03281×-0.02346+Btau03290×0.03198+Btau03315×0.02413+Btau03318×0.02768+Btau03324×0.02111+Btau03334×0.04778+Btau03344×0.01775+Btau03413×-0.03795+Btau03478×-0.02023+Btau03480×0.04605+Btau03514×0.02673+Btau03567×0.04433+Btau03572×0.05075+Btau03612×0.01943+Btau03654×-0.02247+Btau03656×0.05059+Btau03717×-0.04446+Btau03760×0.03482+Btau03782×0.02625+Btau03807×-0.02885+Btau03816×0.0241+Btau03829×0.0241+Btau03845×0.0517+Btau03880×-0.02683+Btau03932×0.04049+Btau03989×0.03493+Btau04018×0.02429+Btau04053×0.01809+Btau04080×-0.02576+Btau04104×-0.04081+Btau04188×-0.02007+Btau04200×0.02085+Btau04236×0.03231+Btau04242×0.02913+Btau04312×0.02161+Btau04361×-0.02518+Btau04377×0.02292+Btau04394×-0.02502+Btau04443×0.02239+Btau04477×-0.02293+Btau04480×0.03328+Btau04517×0.0661+Btau04568×0.02455+Btau04630×0.03752+Btau04634×-0.0239+Btau04787×-0.01753+Btau04808×0.0201+Btau04942×0.03591+Btau05141×0.02037+Btau05398×0.05102+Btau05450×-0.0189+Btau05468×0.02602+Btau05555×0.03922+Btau05565×0.01776+Btau05594×-0.03665+Btau05638×-0.02257+Btau05673×-0.02969+Btau05707×0.02397+BtauMC1R×0.11816