10.3.3 (제3법) 대립유전자 다중분석법

대립유전자 다중분석법은 시중에 유통 또는 판매 되는 쇠고기의 시료로부터 Genomic DNA추출 등의 절차를 통해 Allele-specific PCR (AS-PCR)를 이용하여 소의 모색과 성별, 한우/비한우 판별을 동시에 판별할 수 있는 PCR 프라이머 세트와 이를 포함하는 PCR 키트를 사용한 소의 모색 및 성별, 한우/비한우를 동시에 판별할 수 있는 PCR 방법이다. 본 PCR 방법 중 모색형(모색유전자) 분석은 소의 모색과 성별을 더욱 간단하고 신속하게 동시에 판별할 수 있으며, 한우형(SNP) 분석은 다중 PCR 산물을 통해 한우/비한우 여부 판단을 한다.

가. 시료 채취

시료 채취는 10.3.1 (제1법) 가. 시료채취법을 기본원칙으로 하고, 시료에 화학약품, 이물질 등이 혼입되어 검정결과에 영향을 미칠 수 있는 시료는 세척 및 선별한다. 또한 분석용 시료는 DNA의 추출 효율성을 높이기 위해 최대한 작은 입자가 되도록 분쇄 하며 시료의 종류를 채취 용기에 기입한다.

나. 검정 방법

1) 쇠고기 등의 시료에서 DNA 추출은 10.3.1 (제1법) (가) 쇠고기 등의 시료에서 DNA 추출을 원칙으로 한다.

2) DNA 농도측정

※ 아래의 DNA농도측정 방법 이외에도 일반적 DNA농도측정기, 아가로즈겔 전기영동을 이용하는 방법, DNA정량측정용 시약 등의 방법으로 농도, 순도를 측정할 수 있다.

가) 전기영동 이용법

(1) 기기 및 장치

전기영동장치, UV/VIS 분광광도계(Spectrophotometer), UV 조사기(Transilluminator), 전자렌지, CCD(또는 폴라로이드) 카메라, 자동전기영동장치 등.

(2) 시약 및 완충용액

(가) TAE Buffer(50배 농축용액)

Tris vase 242 g, Glacial acetic acid 57.1 mL, 0.5 M EDTA(pH 8.0) 100 mL를 넣고완전히 용해한 후 증류수로 볼륨을 맞춘다. 전기영동시 1xTAE로 희석 하여 이용한다.

(나) 전기영동 겔 Loading buffer(6배 농축용)

최종농도가 0.25% bromphenol blue, 0.25% xylene cyanol FF, 15% Ficoll이 되도록 혼합한다.

(3) 기타

(가) Ethidium bromide 농축액: 10 mg/mL로 갈색병 또는 차광 보관.

(나) 1% agarose gel

Agarose 1 g을 1xTAE buffer 100 mL에 넣고 전자렌지로 가열하여 녹인 다음에 60℃ 정도가 되면 Ethidium bromide 농축액 2 μL를 첨가하여 혼합한 후, 겔트레이에 넣어 굳힌다.

(4) 분석절차

(가) 시료로부터 추출한 DNA 원액 5 μL에 전기영동용 Loading buffer 1 μL를 혼합하여 1% 아가로스 겔에 loading 한 후 100 volt 전압으로 10분 동안 전기영동한다.

(나) Gel loading dye의 BPB(Bromphenol Blue)가 gel의 2/3 정도까지 진행되면 전기영동을 멈추고 UV 조사가(transilluminator) 위에 겔을 올려 CCD(또는 폴라로이드) 카메라 등으로 촬영하고 화상데이터로 보존한다.

(다) 전기영동 결과로 DNA의 분해여부, RNA 및 당류 등의 혼재 여부 등 추출한 DNA에 대한 순도를 확인한다. 또한 마커 DNA의 Loading 양과 비교하여 추출량도 어느 정도 확인할 수 있다. DNA의 순도 및 추출량에 대한 자세한 분석방법은 분광광도계 이용법에 따른다.

나) 분광광도계 이용법

(1) 기기 및 장치

UV/VIS 분광광도계(spectrophotometer), UV cell, Nano-drop 등

(2) 분석절차

(가) 원액 DNA를 멸균증류수로 적당히 희석하여 260 nm에서의 흡광도(O･D)를 측정 한다.

(나) 분광광도계를 이용하여 230 nm, 260 nm, 280 nm에서의 흡광도를 측정하여 추출된 DNA의 순도를 측정한다. 참고로 260 nm/280 nm에서의 흡광도 비율이 1.8이상이면 이상적인 순도이다.

(다) 260 nm에서의 흡광도가 1일 때의 DNA 농도는 50 ng/μL이므로 추출한 DNA의 농도계산은 아래와 같다.

※ DNA농도(ng/μL) = 260 nm에서의 흡광도 x 50 x 희석배수

(라) 원액 DNA를 PCR분석에 적당한 농도가 되도록 멸균증류수로 희석하여 PCR용 DNA로 사용하며 -20℃이하에서 보관한다.

(마) 원액 DNA의 농도가 PCR에 필요한 농도보다 낮을 경우에는 원액 DNA를 그대로 이용한다.

3) DNA 시료의 검정 및 결과 판정

※ 대립유전자 다중분석법을 사용한 쇠고기 원산지 검정(한우/비한우 검정)시 모색형 (모색유전자)분석과 한우형(SNP) 분석을 실시한 두 결과를 종합하여 최종 검정결과를 낸다.

가) 모색형 분석(모색유전자 프라이머 이용한 PCR분석)

소의 18번 염색체 extension 좌위에 위치하는 Melanocortin1 receptor(MC1R)는 melanocyte에 존재하며, melanocyte simulating hormon(MSH)과 adreno corticotropin hormon(ACTH)간의 상호 작용에 의한 멜라닌의 합성 및 확산 현상을 자극하는 호르몬 수용체로 알려져 있다. 이러한 MC1R유전자의 돌연변이에 의해 발생하는 대립 유전자의 조합(흑색형：ED/ED, ED/E+, ED/e, 황색형： E+/E+, E+/e, e/e)에 따른 개체의 표현형을 확인하여 소의 모색을 구분할 수 있다.

명칭	염기서열 (5‘ → 3’)
CON F	ccattgccaagaaccgc***** (서열목록 제 1 서열)
CON R	atcctccacgctcgg***** (서열목록 제 2 서열)
296 C F	acgtgctggagacggcagtc***** (서열목록 제 3 서열)
310 T R	acggccgcctgggtggccagg***** (서열목록 제 4 서열)
SRY F	cgaagacgaaagktg***** (서열목록 제 5 서열)
SRY R	gcttttcagcatctgtaag***** (서열목록 제 6 서열)

(1) PCR 분석

(가) 시약은 모색유전자를 판별할 수 있는 마커를 사용한다.

(나) 2 x Multiplex Smart mix 12.5μL, Genomic DNA(100ng/μL) 2μL, Primer mix 3.0μL, 3차 증류수 7.5μL를 혼합하여 PCR 반응액을 제조한다.

(다) (나)의 PCR반응액을 25μL씩 PCR tube에 넣고 PCR기기에 장착한 후 아래의 조건으로 PCR을 수행한다.

95℃	95℃
15:00	0:20		64℃		72℃	72℃
					0:50	3:00
			0:30					4℃
	30 Cycles							∞

(라) PCR 결과물 12 μL씩 3% 아가로스겔에 15분간 전기영동을 하여 밴드 확인을 한다.

(마) 3% agarose gel

Agarose 3 g을 1xTAE buffer 100 mL에 넣고 전자렌지로 가열하여 녹인 다음 60℃ 정도가 되면 Ethidium bromide 농축액 2 μL를 첨가하여 혼합한 후 겔트레이에 넣어 굳힌다.

(2) 결과 판정

(가) 황색형 : 225bp의 ED형의 밴드는 없고 151bp의 e형의 밴드가 나타난다.

(나) 흑색형 : 황색형의 밴드를 제외한 밴드 형태가 나타난다.

(다) 성별구분 : 100bp의 SRY형 밴드가 있으면 숫소, 나타나지 않으면 암소 이다.

단, 실험결과 표준밴드인 308bp의 CON밴드가 형성되지 않으면 그 실험은 무효로 인정하고 재실험을 실시한다.

나) 한우형 분석(SNP 프라이머 이용한 PCR분석)

소의 염색체 상에 존재하는 대립유전자내 단일염기에 의하여 한우형과 비한우형을 분석하여 소의 한우 및 비한우를 여부를 판정할 수 있다.

Size	SNP No.	Order name	seq.	Conc.
(bp)				(pmole/ rxn)
300	52956	12-F *(A)	tgacagttccttttggtgtgtttc*****	10
		12-R	cttccttggtggctcaga*****
270	57586	11-F	cgtggaagcagaaaggaaa**	20
		11-R (A)	atgttaggggatgagaacact*
250	7563	10-F	ccggagtttgctcct*****	20
		10-R (A)	gccactgtttgcttatcaga**
230	49078	09-F (A)	tcattgtcctagtgtacaattctg*****	20
		09-R	gtgctcggccttattta*****
210	20572	08-F (A)	actacagtgagaagcccgtg*	3
		08-R	tatttggctgcactggg*****
190	7581	07-F	gtccttggcctctctg*****	5
		07-R (A)	ggatttgggagttctggggatg**
175	56027	06-F (A)	ggcagtggaattctgggcag***	3
		06-R	agaacaaaacccaaactca***
160	23765	05-F (A)	atctggttttggggcc*****	10
		05-R	gaagatacccactgcat*****
145	15562	04-F	acgcccctggcctg*****	2
		04-R (A)	ccagtagtctttgtgcagca***
130	57585	03-F (A)	gaggaggaggaacaccatcaag**	5
		03-R	gttttatgaagaataactg***
115	49615	02-F (A)	tggtaatgatgagagctccag***	7
		02-R	aagttctccctgtctcagt*****
100	MDH2	01-F	ggggcctctggagga*****	2
		01-R	ctccgggcgtgtgag*****

(1) PCR 분석

(가) 시약은 11종의 단일염기다형성 마커와 내재유전자 마커를 사용한다.

(나) 2 x Multiplex Smart mix 12.5 μL, Genomic DNA(100 ng/μL) 2 μL, Primer mix 3.0 μL, 3차 증류수 7.5 μL를 혼합하여 PCR반응액을 제조한다.

(다) (나)의 PCR반응액을 25 μL씩 PCR tube에 넣고 PCR기기에 장착한 후 아래의 조건으로 PCR을 수행한다.

95℃	95℃
15:00	0:20		64℃		72℃	72℃
					0:50	3:00
			0:30					4℃
	30 Cycles							∞

(라) PCR 결과물 12 μL씩 3% 아가로스겔에 30분간 전기영동을 하여 밴드 확인을 한다.

(마) 3% agarose gel

Agarose 3 g을 1xTAE buffer 100 mL에 넣고 전자렌지로 가열하여 녹인 다음 60℃ 정도가 되면 Ethidium bromide 농축액 2 μL를 첨가하여 혼합한 후 겔트레이에 넣어 굳힌다.

(2) 결과 판정

(가) 한우형 : 표준밴드(MDH2) 포함하여 5개이하 (1-5개) 밴드가 나타난다.

(나) 비한우형 : 표준밴드(MDH2) 포함하여 6개 이상 (6-12개) 밴드가 나타난다.

다) 최종 결과 판정

(1) 대립유전자 다중분석법을 이용한 원산지 검정 최종 판정: 모색형(모색유전자) 분석과 한우형(SNP)분석을 종합하여 최종적으로 다음과 같이 판정 한다.

(가) 한우 : 모색형(모색유전자) 분석시 황색형 + 한우형(SNP) 분석시 한우형으로 판정 된다.

(나) 비한우

① 모색형(모색유전자) 분석결과 흑생형으로 판정 될 경우 한우형(SNP) 분석을 생략할 수 있다.

② 모색형(모색유전자) 분석결과 황색형이나 한우형(SNP) 분석은 비한우로 판정된다.