7.1.3.43 아시벤졸라-에스-메틸(Acibenzolar-S-methyl)

가. 시험법 적용범위곡류, 과일류, 채소류 등 식품에 적용한다.

나. 분석원리시료를 메탄올로 추출하고 염산을 이용하여 디클로르메탄으로 산-염기 분배, 추출한 후 액체크로마토그래프로 분석한다.

다. 장치

1) 액체크로마토그래프-자외선흡광검출기(HPLC-UVD)

2) 액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 특급

2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액 : 아시벤졸라-산 표준품을 아세토니트릴에 녹여 500 mg/L가 되게 한다.

4) 표준용액 : 표준원액을 일정량 취하여 아세토니트릴에 녹여 적당한 농도로 각각 혼합, 희석한다.

5) 기타 시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

마. 시험용액의 조제

1) 추출
시료(곡류는 20 g, 채소류 및 과일류 25 g)를 정밀히 달아 추출 용기에 넣고(곡류 등 건조 시료는 물 20 mL를 넣은 후 혼합하여 2시간 방치), 물 16 mL와 1 N 수산화나트륨 용액 4 mL를 넣어 60℃에서 1시간 동안 반응하여 공기 중에서 상온까지 식힌 후 메탄올 100 mL, 염화칼슘 2 g을 넣어 1시간 동안 강하게 흔들어 섞는다. 이를 여과지가 깔려있는 부흐너깔때기로 흡인 여과하고, 잔류물을 아세톤 20 mL로 씻어 내려 앞의 여과액과 합치고 메탄올을 이용하여 150 mL로 맞춘다. 이 중 60 mL를 취하여 분액깔때기에 옮겨 포화염화나트륨 용액 50 mL, 디클로르메탄 50 mL를 넣어 2분간 강하게 흔들어 층이 완전히 분리될 때까지 정치하여 층을 분리시킨 후 디클로르메탄층을 버리는 과정을 2회 반복한다. 수용액 층에 1 N 염산 20 mL, 디클로르메탄 100 mL를 넣어 흔들어 섞은 후 디클로르메탄층을 무수황산나트륨에 통과시켜 받는 과정을 2회 반복한다. 이를 40℃ 이하에서 감압 농축하고 잔류물에 아세토니트릴 2 mL를 넣어 녹인 후 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프의 분석조건

가) 컬럼 : C18(4.6 mm × 250 mm, 5.0 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상 :0.1% 아세트산 함유 아세토니트릴과0.1% 아세트산 함유 물(20 : 80)의 혼합액

다) 이동상 유속: 1 mL/분

라) 컬럼 온도 : 40℃

마) 검출파장 : 235 nm

바) 주입량 : 20 μL

2) 검량선의 작성
표준용액을 농도별로 일정량을 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

3) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 예시.

아시벤졸라-산(9.3분)

4) 정량한계
0.05 mg/kg

사. 정량시험위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 검량선에 대입하여 정량한다.

아. 확인시험액체크로마토그래프-질량분석기상의 머무름 시간과 질량분석 스펙트럼으로 아시벤졸라-산을 확인한다.

1) 액체크로마토그래프-질량분석기의 분석조건

가) 컬럼 : C18(2.1 mm × 150 mm, 3.0 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상 : 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴과0.1% 포름산 함유 물(20 : 80)의 혼합액

다) 이동상 유속: 0.3 mL/분

라) 컬럼 온도 : 30℃

마) 주입량 : 5 μL

바) 이온화 : ESI positive-ion mode

사) 분자량 범위 : 50～500m/z

아) 액체크로마토그래프-질량분석기 분석을 위한 특성이온

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	이온 (m/z)
아시벤졸라-산 (Acibenzolar-acid)	3.8	180.2	181