.1.3.65 프로헥사디온-칼슘(Prohexadione-calcium)

가. 시험법 적용범위곡류, 서류, 과일류, 채소류 등 식품에 적용한다.

나. 분석원리시료를 5 N 황산 함유 아세토니트릴로 추출한 후 음이온 교환 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프로 분석한다.

다. 장치

1) 액체크로마토그래프-자외선흡광검출기(HPLC-UVD)

2) 액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매 및 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액 : 표준품을 메탄올에 녹여 500 mg/L가 되게 한다.

4) 표준용액 : 표준원액을 0.2% 포름산 : 아세토니트릴(70 : 30) 혼합액으로 희석하여 0.02, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 mg/L가 되도록 하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다.

5) 0.02 M 초산암모늄(ammonium acetate) 용액 : 초산암모늄 0.16 g을 물에 녹여 100 mL가 되게 한다.

6) 5% 인산수소이나트륨(disodium hydrogen phosphate) 용액 : 인산수소이나트륨 5 g을 물에 녹여 100 mL가 되게 한다.

7) 1% 포름산(formic acid) 용액 : 포름산 1 mL를 물에 녹여 100 mL가 되게 한다.

8) 0.2% 포름산(formic acid) 용액 : 포름산 0.2 mL를 물에 녹여 100 mL가 되게 한다.

9) 음이온 교환 카트리지 : 음이온 교환 수지 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지(500 mg, 6 mL)를 사용한다.

마. 시험용액의 조제

1) 추출
시료 20 g을 정밀히 달아 추출용기에 넣고, 5 N 황산 용액 1 mL와 아세토니트릴 100 mL를 넣어 3분간 강하게 흔들어 추출한다. 부흐너깔때기로 흡입 여과하고 아세토니트릴 40 mL로 잔류물 및 용기를 씻어 상기 여과액과 합하여 40℃ 이하에서 10 mL 정도 남을 때까지 감압 농축한 후 5% 인산수소이나트륨 용액 100 mL를 넣어 녹인다. 이를 분액깔때기에 옮기고 헥산 50 mL를 넣어 강하게 흔들어 10분간 정치하여 층을 분리시킨 후 물층을 취하여 10 N 인산 용액을 넣어 pH 3으로 맞춘다. 물층에 포화염화나트륨 용액 30 mL와 디클로로메탄 50 mL를 넣어 강하게 흔든 후10분간 정치하여 층을 분리시킨 후 디클로로메탄층을 무수황산나트륨 15 g에 통과시켜 탈수한 후 감압농축플라스크에 취한다. 물층에 다시 디클로로메탄 50 mL를 넣어 강하게 흔들어 10분간 정치하여 층을 분리시킨 후 디클로로메탄층을 탈수하여 상기 감압농축플라스크에 합한다. 이를 40℃ 이하에서 감압 농축한 후 잔류물에 0.02 M 초산암모늄 용액 10 mL를 넣어 녹인다.

2) 정제
음이온 교환 카트리지에 메탄올 5 mL를 넣고 고정상 상단에 소량의 메탄올이 남을 정도까지 유출시켜 버리고 다시 0.02 M 초산암모늄 용액 5 mL를 넣어 유출시켜 버린다. 고정상 상단이 노출되기 전에 ‘1) 추출’로부터 얻은 0.02 M 초산암모늄 용액 10 mL를 고정상 에 넣어 유출시켜 버린다. 고정상 상단이 노출되기 전에 물 5 mL와 0.02 M 초산암모늄 : 메탄올(80 : 20) 혼합액 5 mL를 각각 넣어 유출시켜 버리고 다시 1% 포름산 용액 9 mL로 용출시켜 10 mL 메스플라스크에 받는다. 이 플라스크에 아세토니트릴을 넣어 최종부피를 10 mL가 되게 하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프의 분석조건

가) 컬럼 : C18(4.6 mm × 250 mm, 5 μm)또는 이와 동등한 것

나) 이동상 : 0.2% 포름산 함유 물과 아세토니트릴(70 : 30)의 혼합액

다) 이동상 유속 : 1 mL/분

라) 컬럼 온도 : 30℃

마) 검출파장 : 275 nm

바) 주입량 : 20 μL

2) 검량선 작성
표준용액 0.02, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 mg/L를 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피크높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

3) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프에서 표준품의 크로마토그램 예시.

프로헥사디온(10.0분)

4) 정량한계
0.01 mg/kg

사. 정량시험위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 피크 면적을 검량선에 대입하여 정량한다.

아. 확인시험액체크로마토그래프-질량분석기상의 머무름 시간과 질량분석 스펙트럼으로 프로헥사디온을 확인한다.

1) 액체크로마토그래프-질량분석기의 분석조건

가) 컬럼 : C18(4.6 mm × 250 mm, 5 μm)또는 이와 동등한 것

나) 이동상 : 0.2% 포름산 함유 물과 아세토니트릴(70 : 30)의 혼합액

다) 이동상 유속 : 0.5 mL/분

라) 컬럼 온도 : 40℃

마) 주입량 : 2 μL

바) 이온화 : ESI negative-ion mode

사) 콘 볼테이지 : 25 V

아) 분자량 범위 : 100～300m/z

자) 액체크로마토그래프-질량분석기 분석을 위한 특성이온

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	이온 (m/z)
프로헥사디온 (Prohexadione)	17.7	212.2	211