7.1.3.85 클로피랄리드(Clopyralid)

가. 시험법 적용범위곡류, 서류, 두류, 과일류, 채소류 등 식품에 적용한다.

나. 분석원리시료를 아세토니트릴로 추출하고 C18과 알루미나를 이용하여 정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

1) 액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 특급

2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액 : 표준품을 아세토니트릴에 녹여 1,000 mg/L가 되게 한다.

4) 표준용액 : 표준원액을 무처리 시료 추출물을 이용하여 적당한 농도로 혼합, 희석한다(무처리 시료 추출물 90% 이상 포함).

5) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

마. 시험용액의 조제

1) 추출
시료 5 g을 정밀히 달아 50 mL 원심분리관에 넣고 5% 포름산을 포함한 아세토니트릴 용액 20 mL를 넣어 10분간 강하게 흔들어 추출한다. 원심분리관에 무수황산마그네슘 4 g과 염화나트륨 1 g, 구연산나트륨이수화물 1 g, 구연산이나트륨·1.5수화물 0.5 g을 넣고 1분간 강하게 흔든 후 4℃, 4,000 G에서 10분간 또는 이와 동등한 조건에서 원심분리한다.

2) 정제
C18(55～105 μm) 350 mg과 알루미나(activated, neutral, 46～279 μm) 0.1 g이 담긴 15 mL 원심분리관에 ‘1) 추출’로부터 얻은 아세토니트릴층 중 10 mL를 취하여 넣은 후, 1분간 강하게 흔들어 섞은 다음 이를 원심분리 등의 방법으로 층을 분리한 후 상층액을 멤브레인 필터(Nylon, 0.2 μm)로 여과한 후 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼 : C18계 역상 컬럼 또는 이와 동등한 것

나) 컬럼 온도 : 40℃

다) 이동상

(1) 이동상 A : 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴

(2) 이동상 B : 0.1% 포름산 함유 물

(3) 농도구배조건

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	5	95
0.5	5	95
3.0	95	5
5.0	95	5
7.0	5	95

라) 이동상 유속 : 0.4 mL/분

마) 주입량 : 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법 : ESI positive-ion mode

나) Capillary voltage : 0.5 kV

다) Collision gas : 아르곤(Ar)

라) 액체크로마토그래프-질량분석기 분석을 위한 특성이온

분석성분 (Compound)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion,m/z)	생성이온(Product ion,m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
클로피랄리드 (Clopyralid)	192.0	190.9	192	1461)	17
				174	10

1)정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프-질량분석기에서 표준품의 크로마토그램 예시.클로피랄리드(3.9분)
* 분석기기: LC(WatersⓇAcquity UPLC), MS/MS(WatersⓇXevo TQ-S),컬럼(Cadenza CD-C18,2.0 mm I.D. × 150 mm L., 3.0 μm)

5) 정량한계
0.01 mg/kg

사. 정량시험위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 검량선에 대입하여 정량한다.

아. 확인시험액체크로마토그래프-질량분석기상의 머무름 시간과 특성이온으로 클로피랄리드를 확인한다.