7.1.3.87 플로르피록시펜벤질(Florpyrauxifen-benzyl)

가. 시험법 적용범위곡류, 서류, 두류, 과일류, 채소류 등 식품에 적용한다.

나. 분석원리시료를 아세토니트릴로 추출한 후 C18카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

1) 액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 특급

2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액 : 플로르피록시펜벤질 및 XDE-848 acid 표준품을 각각 아세토니트릴에 녹여 1,000 mg/L가 되게 한다.

4) 표준용액 : 표준원액을 무처리 시료 추출물을 이용하여 적당한 농도로 혼합, 희석한다(무처리 시료 추출물 90% 이상 포함).

5) C18카트리지 : C18(500 mg) 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지(용량 6 mL) 또는 이와 동등한 것

6) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

마. 시험용액의 조제

1) 추출
시료 10 g을 정밀히 달아 추출 용기에 넣고( 곡류 및 두류 등 건조시료의 경우 물 20 mL를 넣고 30분간 방치) 아세토니트릴 50 mL를 넣어 10분간 강하게 흔들어 추출한다. 추출물을 여과지가 깔려있는 부흐너깔때기에 통과시켜 흡인 여과하고 아세토니트릴 20 mL로 잔류물 및 용기를 씻어내려 앞서의 여과액과 합친 뒤 40℃ 이하에서 감압 농축한다. 잔류물에 물 100 mL를 넣어 흔들어 섞은 후 분액깔때기에 옮기고 염화나트륨 10 g을 넣고 디클로로메탄 30 mL를 차례로 넣어 강하게 흔든다. 층이 완전히 분리될 때까지 정치 하고, 디클로로메탄층을 무수황산나트륨에 통과시켜 농축플라스크에 받고, 남아있는 수용액 층에 디클로로메탄 30 mL를 추가로 넣어 위의 과정을 반복한다. 이 후 남아있는 수용액층에 1 N 염산용액을 천천히 가해 pH 3으로 조절하여 디클로로메탄 30 mL를 차례로 넣고 강하게 흔든다. 층이 완전히 분리될 때까지 정치시킨 후 디클로로메탄층을 무수황산나트륨에 통과시켜 농축플라스크에 받는다. 수용액 층에 디클로로메탄 30 mL를 추가로 넣어 위의 과정을 반복하고 합친 분배 추출액을 40℃ 이하에서 감압 농축, 용매를 완전 증발시킨다. 잔류물을 메탄올 : 디클로로메탄(40 : 60) 혼합액 10 mL에 녹인다.

2) 정제
C18카트리지에 1～2 방울/초의 속도로 디클로로메탄 5 mL를 유출시켜 활성화한다. 고정상 상단이 노출되기 직전에 ‘1) 추출’로부터 얻은 추출액 5 mL를 카트리지에 넣고 1～2 방울/초의 속도로 용출하여감압농축플라스크에 받고, 고정상 상단이 노출되기 전에 메탄올 : 디클로로메탄(10 : 90) 혼합액 10 mL를 넣고 용출액을 농축플라스크에 받은 후 40℃ 이하에서 감압 농축, 용매를 완전 증발시킨다. 잔류물을 아세토니트릴 5 mL에 녹인 후멤브레인 필터(PTFE, 0.2 μm)로 여과하여 시험용액으로 사용한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼 : C18계 역상 컬럼 또는 이와 동등한 것

나) 컬럼 온도 : 40℃

다) 이동상

(1) 이동상 A : 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴

(2) 이동상 B : 0.1 % 포름산 함유 물

(3) 농도구배조건

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	20	80
1.0	20	80
4.0	80	20
9.0	80	20
12.0	20	80

라) 이동상 유속 : 0.2 mL/분

마) 주입량 : 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법 : ESI positive-ion mode

나) Capillary voltage : 1.0 kV

다) Collision gas : 아르곤(Ar)

라) 액체크로마토그래프-질량분석기 분석을 위한 특성이온

분석성분 (Compound)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion,m/z)	생성이온(Product ion,m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
플로르피록시펜벤질 (Florpyrauxifen-benzyl)	439.2	438.0	439	911)	22
				393	27
XDE-848 acid	349.1	347.9	349	3031)	22
				268	30

1)정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프-질량분석기에서 표준품의 크로마토그램 예시.
A : 플로르피록시펜벤질(5.8분), B : XDE-848 acid(4.3분)
* 분석기기 : LC(WatersⓇAcquity UPLC), MS/MS(WatersⓇUS/Quattro premier XE),컬럼(XBridgeⓇC18,2.1 mm I.D. × 100 mm L., 3.5 μm)

5) 정량한계
0.01mg/kg

사. 정량시험위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 검량선에 대입하여 정량한다.

아. 확인시험액체크로마토그래프-질량분석기상의 머무름 시간과 특성이온으로 플로르피록시펜벤질 및 대사산물 XDE-848 acid를 확인한다.