6.3.2.3.1 인지질

가. 핵자기공명분광기에 의한 정량(제1법)

1) 시험법 적용범위

크릴유에 적용한다.

2) 분석원리

시료 중의 인지질을 클로로포름과 메탄올로 추출 후 핵자기공명분광기를 이용하여 정량하는 방법이다.

3) 장치 및 기구

가) 장치

(1) 핵자기공명분광기(NMR, 최소 300 Mhz 이상)

나) 기구

(1) 유리 메디아병(250 mL)

(2) 유리바이알

(3) 1 mL 케미칼 실험용 일회용 주사기(all plastic syringe)

(4) 칼·가위 등의 커팅 도구

(5) 유리섬유 시린지 필터

(6) 교반기(vortex mixer)

(7) 원심분리기

(8) 질소농축기

(9) 분석저울(0.0001g 까지 측정 가능)

4) 시약 및 시액

가) 시약

(1) 증류수

(2) 중수소클로로포름(chloroform-d)[중수소비율: 99.8 이상, 테트라메틸실란(tetramethylsilane) 0.05% (v/v)]

(3) 중수소메탄올(methanol-d4)[중수소비율: 99.8 이상, 테트라메틸실란(tetramethylsilane) 0.05% (v/v)]

(4) 탄산세슘(Cesium carbonate, CsCO3)

(5) 이.디.티.에이(EDTA(Ethylene diamine tetraacetic acid))

(6) 클로로포름(HPLC grade)

(7) 메탄올(HPLC grade)

나) 내부표준물질

(1) 트리페닐인산(Triphenyl phosphate)(TPP, 31P-qNMR Standard grade)

다) 시액

(1) 클로로포름/메탄올 혼합액: 클로로포름, 메탄올을 2:1의 부피비로 혼합하여 조제한다.

(2) 이.디.티.에이, 탄산세슘 혼합액: 0.2 M 이.디.티.에이 용액을 제조한 후, 1 M 탄산세슘 용액을 이용하여 pH를 7.2 ～ 7.5로 하여 조제한다.

5) 시험용액의 조제

가) 액상 시료

(1) 유리바이알에 트리페닐인산 20 ～ 25 mg를 넣은 뒤 정확한 무게를 기록하고, 300 ～ 350 mg의 액상(원료) 시료를 넣고 정확한 무게를 기록한다.

(2) 유리바이알에 중수소클로로포름, 중수소메탄올을 각각 1 mL씩 넣고 잘 녹인 후 이.디.티.에이, 탄산세슘 혼합액을 1 mL 씩 넣고 30분간 충분히 섞은 후 원심분리한다. 하부의 유기용매층을 핵자기공명분광기 튜브에 옮겨 담은 것을 시험용액(최소 0.6 mL 이상)으로 한다.

나) 캡슐 제품

(1) 캡슐 제품의 경우, 크릴유 5g 정도에 해당하는 수의 캡슐을 핀셋, 커팅도구를 이용해 반으로 자른 뒤 유리 메디아병에 넣고, 핀셋, 면도칼(커팅도구)에 묻은 시료는 클로로포름/메탄올 혼합용액으로 씻어내어 유리 메디아병에 합친다. 50 mL의 클로로포름/메탄올 혼합용액을 추가하여 넣고 내용물을 완전히 용해시킨 후, 100 mL 부피플라스크에 옮긴다. 유리병, 빈 캡슐 등은 30 mL의 클로로포름/메탄올 혼합용액으로 씻어내어 부피플라스크에 합치고 클로로포름/메탄올 혼합용액으로 부피플라스크의 표선까지 채워 균일하게 섞은 것을 시험원액으로 한다.

(2) 유리바이알에 트리페닐인산 20 ～ 25 mg을 넣은 뒤 정확한 무게를 기록한다. 여기에 크릴유 300 ～ 350 mg에 해당하는 시험원액(통상, 캡슐 당 내용량이 1,000 mg일 경우, 6 mL을 취한다.)을 넣은 후 가해진 시험원액의 정확한 양을 기록하고 질소농축기를 이용하여 용매를 완전히 제거한다.

(3) 유리바이알에 중수소클로로포름과 중수소메탄올을 각각 2 mL씩 넣고 잘 녹인 후 이.디.티.에이, 탄산세슘 혼합액을 2 mL 넣고 30분간 충분히 섞은 후 원심분리한다. 하층의 유기용매층을 핵자기공명분광기 튜브에 옮겨 담은 것을 시험용액(최소 0.6 mL 이상)으로 한다.

6) 분석 및 계산

가) 핵자기공명분광기의 측정조건

※ 감도(sensitivity) 및 선모양(line shape) 테스트는 핵자기공명분광기 제조사에서 규정하는 점검 기간 내에 수행되어져야 한다. 이때, 최소 월간점검의 수행이 요구되며 분해능(Resolution) 테스트는 매 분석 시 마다 수행하고 분석결과와 함께 제시하여야 한다.

(1) 반복측정(number of transients) : 128회 이상

(2) 측정 간 이완 시간(relaxation delay) : 10 sec 이상

(3) FID(free induction decay) 측정 시간(acquisition time) : 5 sec 이상

(4) 펄스 넓이(pulse width) : 45○

(5) 측정 온도(temperature) : 25°C

(6) 펄스 프로그램(pulse program) : 1H-decoupled 31P (inverse gated)

(7) 스펙트럼 폭(spectral width) : 50 ppm(-25 ppm to 25 ppm)

(8) 트랜스미터 오프셋(transmitter offset) : 스펙트럼 폭의 중심, 0 ppm

(9) 데이터 셋의 크기(size of data set) : 64K (32K with zero-filling) 이상

나) 계산

(1) 계산

(가) 인지질 함량(wt/wt%) = 포스파티딜콜린(PC) 함량(wt/wt%) + 리소포스파티딜콜린(1-리소포스파티딜콜린(1-LPC)과 2-리소포스파티딜콜린(2-LPC)) 함량(wt/wt%) + 포스파티딜에탄올아민(PE) 함량(wt/wt%) + N-아실-포스파티딜에탄올아민(NAPE) 함량(wt/wt%) + 리소포스파티딜에탄올아민(LPE) 함량(wt/wt%) + 기타(Others) 함량(wt/wt%)

(나) 각 인지질 함량(wt/wt%)

CPL(wt%) = (MWPL x molPL x 100) / WS

CPL = 시험용액 중 개별 인지질의 함량(%, w/w)

MWPL = 개별 인지질의 분자량(g/mol, 표 1. 참고)

Ws = 시료채취량(g)

※ 캡슐 제품의 경우, 동 시험과는 별도로 캡슐 당 내용량 확인시험을 하여야 하며, Ws = 시험원액을 취한 부피(mL) × 시험원액 농도[(1캡슐 당 내용량(mg/캡슐) × 캡슐 수) ÷ 100mL]

molPL = 시험용액 중 개별 인지질의 mole수(mol) = (IPL x AIS x molIS) / (IIS x APL)

IIS= 내부표준물질의 피크면적 IPL= 개별 인지질의 피크면적 AIS= 내부표준물질의 분자당 인의 원자수(atoms/mol) APL= 개별 인지질의 분자당 인의 원자수(atoms/mol) molIS= 시험용액 중 내부표준물질의 mole수(mol) =(WISx CIS) / (MW ISx 100) WIS= 시험용액에 첨가한 내부표준물질의 량(g) CIS= 내부표준물질의 순도(%) MWIS= 내부표준물질의 분자량, 326.3g/mol

[IMG NAME : PIC1922148070]

그림 1. 크릴유의 인 핵자기공명(31P NMR) 스펙트럼

성분	Chemical shift (ppm)	분자량 (g/mol)	분자당 인의 수
TPP(Triphenyl phosphate, internal STD)	-17.8	326.3	1
PC(Phosphatidylcholine)	-0.93	791	1
1-LPC(1-Lysophosphatidylcholine)	-0.49	534.5	1
2-LPC(2-Lysophosphatidylcholine)	-0.39	534.5	1
PE(Phosphatidylethanolamine)	-0.19	770	1
NAPE(N-acyl-phosphatidylethanolamine)	-0.06	1032	1
LPE(Lysophosphatidylethanolamine)	0.29	492.5	1
기타		800

나. 액체크로마토그래프에 의한 정량(제2법)

1) 시험법 적용범위

크릴유의 제조·가공기준 확인시 제1법을 대체하여 사용할 수 있다. 이때 제2법에 따른 판정이 제1법에 따른 판정과 상이한 경우에는 제1법의 결과를 우선한다.

2) 분석원리

시료 중의 인지질을 클로로포름과 메탄올로 추출 후 질소로 농축한 후 헥산과 이소프로판올로 녹여 순상칼럼으로 분리한 후 액체크로마토그래프/증기화광산란검출기를 이용하여 정량하는 방법이다.

3) 장치 및 기구

가) 장치

액체크로마토그래프/증기화광산란검출기(LC/ELSD)

나) 기구

(1) 유리 메디아병(250 mL)

(2) 유리바이알

(3) 부피플라스크(10 mL, 100 mL 및 200 mL)

(4) 멤브레인 필터(0.45 μm)

(5) 1 mL 케미칼실험용 일회용 주사기(all plastic syringe)

(6) 칼·가위 등의 커팅 도구

(7) 유리섬유 시린지 필터

(8) 교반기(vortex mixer)

(9) 원심분리기

(10) 질소농축기

(11) 분석저울(0.0001g 까지 측정 가능)

4) 시약 및 시액

가) 시약

(1) 증류수 : 3차 증류수

(2) n-헥산 : HPLC grade

(3) 이소프로판올 : HPLC grade

(4) 아세트산

(5) 트리에틸아민

(6) 클로로포름 : HPLC grade

(7) 메탄올 : HPLC grade

(8) 포스파티딜콜린(Phosphatidylcholine) : CAS No. 97281-47-5 또는 이와 동등한 것

(9) 리소포스파티딜콜린(1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine, LPC) : CAS No. 17364-16-8 또는 이와 동등한 것

(10) 포스파티딜에탄올아민(Phosphatidylethanolamine, PE) : CAS No. 39382-08-6 또는 이와 동등한 것

(11) N-아실-포스파티딜에탄올아민(N-acyl-Phosphatidylethanolamine, NAPE) : European Pharmacopoeia (EP) Reference Standard 또는 이와 동등한 것

나) 표준용액

(1) 표준원액 : 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, N-아실-포스파티딜에탄올아민을 각각 100 mg을 n-헥산/이소프로판올 혼합액(8:2, v/v) 100 mL에 녹여 조제한다.

(2) 표준용액 : 표준원액을 n-헥산/이소프로판올 혼합액(8:2, v/v)로 적절히 희석하여 표준용액으로 한다.

다) 시액

(1) n-헥산/이소프로판올 혼합액 : n-헥산과 이소프로판올을 8:2의 부피비로 혼합하여 조제한다.

(2) 클로로포름/메탄올 혼합액 : 클로로포름, 메탄올을 2:1의 부피비로 혼합하여 조제한다.

(3) 이동상 A : n-헥산, 이소프로판올, 아세트산 및 트리에틸아민을 81.42:17.00:1.50:0.08의 부피비로 혼합한 후 0.45 μm 여지로 여과하고 탈기하여 조제한다.

(4) 이동상 B : 이소프로판올, 증류수, 아세트산, 트리에틸아민을 84.42:14.00:1.50:0.08의 부피비로 혼합한 후 0.45 um 여지로 여과하고 탈기하여 조제한다.

5) 시험용액 조제

가) 시험원액 조제

(1) 액상 시료

액상의 시료 약 2,500 mg을 취하여 100 mL 부피플라스크에 넣은 후 n-헥산/이소프로판올 혼합액을 넣어 녹인 뒤, n-헥산/이소프로판 혼합액으로 정용한 것을 시험원액으로 한다.

(2) 캡슐 제품

캡슐 제품인 경우, 크릴유 5g 정도에 해당하는 수의 캡슐을 핀셋, 커팅도구를 이용해 반으로 자른 뒤 유리 메디아병에 넣고, 핀셋, 면도칼(커팅도구)에 묻은 시료는 클로로포름/메탄올 혼합용액으로 씻어내어 유리 메디아병에 합친다. 50 mL의 클로로포름/메탄올 혼합용액을 추가하여 넣고 내용물을 완전히 용해시킨 후, 100 mL 부피플라스크에 옮긴다. 유리병, 빈 캡슐 등을 30 mL의 클로로포름/메탄올 혼합용액으로 씻어내어 부피플라스크에 합치고 클로로포름/메탄올 혼합용액으로 부피플라스크의 표선까지 채워 균일하게 섞은 것을 시료액(★)으로 한다. 유리바이알에 크릴유 시료액(약 5mL)을 넣은 후 질소 농축기를 이용하여 용매를 완전히 제거한다. 용매가 제거된 유리바이알에 n-헥산/이소프로판올 혼합용액을 소량 넣고 녹인 후, 10 mL 부피플라스크로 옮긴 뒤 n-헥산/이소프로판올 혼합용액으로 정용한 것을 시험원액(☆)으로 한다.

나) 시험용액 조제

시험원액을 0.45 μm 나일론 멤브레인 필터로 여과한 여과액을 포스파티딜에탄올아민, N-아실-포스파티딜에탄올아민의 시험용액으로 하고, 여과액을 n-헥산/이소프로판올 혼합용액으로 2배 희석하여 리소포스파티딜콜린의 시험용액으로 하고, 여과액을 n-헥산/이소프로판올 혼합용액으로 20배 희석하여 포스파티딜콜린의 시험용액으로 한다.

6) 시험방법

가) 액체크로마토그래프 조건

(1) 칼럼 : Diol-bounded silica column(4.0 mm × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

(2) 칼럼온도 : 55℃

(3) Drift tube Temp. : 50℃

(4) 증기화광산란검출기 Pressure(N2 gas) : 2.5 bar

(5) 유 속 : 1.0 mL/min

(6) 주입량 : 20 μL

(7) 이동상

(가) 이동상 A : n-헥산:이소프로판올:아세트산:트리에틸아민(81.42:17.00:1.50:0.08, v/v/v/v)

(나) 이동상 B : 이소프로판올:증류수:아세트산:트리에틸아민(84.42:14.00:1.50:0.08, v/v/v/v)

시간(분)	이동상 A(%)	이동상 B(%)
0	95	5
5	80	20
8.5	60	40
15.0	0	100
17.5	95	5
34.0	95	5

나) 검량선 작성

각 표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프/증기화광산란검출기에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램 상의 각 피크 면적을 구하고 검량선을 작성한다.

7) 정량시험

표준용액과 시험용액의 크로마토그램상의 피크의 머무름 시간과 일치할 때 면적을 검량선에 대입하여 시험용액 중의 각 인지질(포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, N-아실-포스파티딜에탄올아민)의 농도(mg/mL)를 구한다.

가) 인지질 함량(wt/wt%) = [포스파티딜콜린 함량(wt/wt%) + 리소포스파티딜콜린 함량(wt/wt%) + 포스파티딜에탄올아민 함량(wt/wt%) + N-아실-포스파티딜에탄올아민 함량(wt/wt%)] × 1.07

나) 각 인지질 함량(wt/wt%) = C × V/S × 희석배수 × [IMG NAME : EQUATION1922148074]

C : 검량선으로부터 얻은 시료의 각 인지질 농도(mg/mL)

V : 시험원액(☆)의 최종부피 (= 10 mL)

희석배수 : N-아실-포스파티딜에탄올아민(1), 리소포스파티딜콜린(2), 포스파티딜콜린(20)

S : 시료 채취량 (g)

※ 캡슐 제품의 경우, 동 시험과는 별도로 캡슐 당 내용량 확인 시험을 하여야 하며, S = 시료액(★) 취한 부피(5 mL) × 시료액 농도[(1캡슐 당 내용량(g/캡슐) × 캡슐 수) ÷ 100 mL]

[IMG NAME : EQUATION1922148075]: 단위환산