7.1.3.97 옥시테트라사이클린(Oxytetracycline)

가. 시험법 적용범위곡류, 서류, 두류, 과일류, 채소류 등 식품에 적용한다.

나. 분석원리시료를 메탄올로 추출한 후 d-SPE(dispersive-Solid Phase Extraction)로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

1) 액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 특급

2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액 : 표준품(Oxytetracycline hydrochloride)을 메탄올에 녹여 1,000 mg/L가 되게 한다.

4) 표준용액 : 표준원액을 무처리 시료 추출물을 이용하여 적당한 농도로 혼합, 희석한다(무처리 시료 추출물 90% 이상 포함).

5) d-SPE : 무수황산마그네슘(MgSO4, anhydrous magnesium sulfate), 1차 2차 아민(PSA, Primary Secondary Amine), C 18(octadecyl bonded silica), 흑연화탄소(GCB, Graphitized C arbon Black)

6) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

마. 시험용액의 조제

1) 추출
시료 5 g을 정밀히 달아 50 mL 원심분리관에 넣고( 곡류 및 두류 등 건조시료의 경우 물 5 mL를 넣고 30분간 방치) 메탄올 15 mL를 가한 뒤 1분간 강하게 흔들고 포름산을 넣어 추출용액의 pH를 4로 맞춘다. 추출물에 염화나트륨 1 g을 넣고 10분간 강하게 흔들어 섞은 후 4℃, 4,000 G에서 10분간 또는 이와 동등한 조건에서 원심분리하여 상층액 8 mL를 취한다.

2) 정제
무수황산마그네슘 1,200 mg과 1차 2차 아민 400 mg, C 18400 mg, 흑연화탄소 45 mg이 미리 담겨져 있는 15 mL 원심분리관에 ‘1) 추출’로부터 얻은 상층액을 30초간 와류교반기 등을 이용하여 충분히 혼합한 후 이를 원심분리 등의 방법으로 층을 분리한 후 상층액을 멤브레인 필터(PTFE, 0.2 μm)로 여과한 후 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼 : C18계 역상 컬럼 또는 이와 동등한 것

나) 컬럼 온도 :40℃

다) 이동상

(1) 이동상 A : 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴

(2) 이동상 B : 0.1% 포름산 함유 물

(3) 농도구배조건

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	5	95
4.0	5	95
4.1	95	5
5.6	95	5
5.7	5	95
6.0	0	100
8.0	0	100
8.1	5	95
10.0	5	95

라) 이동상 유속 : 0.2 mL/분

마) 주입량 : 2 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법 : ESI positive-ion mode

나) Capillary voltage : 1.7 kV

다) Collision gas : 아르곤(Ar)

라)액체크로마토그래프-질량분석기 분석을 위한 특성이온

분석성분 (Compound)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion,m/z)	생성이온(Product ion,m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
옥시테트라사이클린 (Oxytetracycline)	460.4	460.1	461	4261)	21
				201	35
				443	15

1)정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 액체크로마토그래프-질량분석기에서 표준품의 크로마토그램 예시.
옥시테트라사이클린(5.5분)
* 분석기기 : LC(ShimadzuⓇNexera X2), MS/MS(ShimadzuⓇLCMS-8060),
컬럼(Cadenza CW-C18, 2.0 mm I.D. × 50 mm L., 3.0 μm)

5) 정량한계
0.01 mg/kg

사. 정량시험위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 검량선에 대입하여 정량한다.

아. 확인시험액체크로마토그래프-질량분석기상의 머무름 시간과 특성이온으로 옥시테트라사이클린을 확인한다.