7.1.3.105 니트라피린(Nitrapyrin)

가. 시험법 적용범위곡류, 서류, 두류, 과일류, 채소류 등 식품에 적용한다.

나. 분석원리시료를2% 포름산 함유 아세토니트릴로 추출한 후 d-SPE(dispersive-Solid Phase Extraction) 및 HLB 카트리지로 정제하여 기체크로마토그래프-질량분석기 및 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

1) 기체크로마토그래프-질량분석기(GC-MS/MS)

2) 액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매 : 잔류농약 시험용 또는 특급

2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액 : 니트라피린 및 대사산물(6-CPA) 표준품을 각각 아세토니트릴에 녹여 1,000 mg/L가 되게 한다.

4) 표준용액 : 표준원액을 무처리 시료 추출물을 이용하여 적당한 농도로 혼합, 희석한다(무처리 시료 추출물 90% 이상 포함).

5) d-SPE : 무수황산마그네슘(MgSO4, anhydrous magnesium sulfate), 1차 2차 아민(PSA, Primary Secondary Amine)

6) HLB 카트리지(Hydrophilic-Lipophilic Balance cartridge) : Divinylbenzene-N -vinylpyrrolidone copolymer(500 mg) 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지(용량 6 mL) 또는 이와 동등한 것.

7) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 특급

마. 시험용액의 조제

1) 추출
시료 5 g을 정밀히 달아 50 mL 원심분리관에 넣고(곡류 및 두류 등 건조시료의 경우 물 10 mL를 넣고 30분간 방치) 2% 포름산 함유 아세토니트릴 20 mL를 넣어 10분간 강하게 흔들어 추출한다. 추출물에 무수황산마그네슘 4 g과 염화나트륨 1 g, 구연산이나트륨·1.5수화물 0.5 g, 구연산삼나트륨·2수화물 1 g을 넣어 1분간 흔들고 4℃, 4,000 G에서 10분간 또는 이와 동등한 조건에서 원심분리하여 니트라피린 분석에는 상층액 1 mL을 취하고, 대사산물 분석에는 상층액 3 mL를 취하여 전량 질소 농축한 후 물을 이용하여 3 mL로 맞춘다.

2) 정제

가) 니트라피린

무수황산마그네슘 150 mg과 1차 2차 아민 25 mg이 미리 담겨져 있는 2 mL 원심분리관에 ‘1) 추출’로부터 얻은 상층액 1 mL를 넣고 30초간 와류교반기 등을 이용하여 충분히 혼합한 후 이를 원심분리 등의 방법으로 층을 분리한다. 정제된 상층액을 멤브레인 필터(PTFE, 0.2 μm)로 여과한 후 시험용액으로 한다.

나) 대사산물(6-CPA)

HLB 카트리지에 메탄올 3 mL와 물 3 mL를 차례로 가하여 2∼3 방울/초의 속도로 유출시켜 활성화한 후 고정상 상단이 노출되기 전에 ‘1) 추출’로부터 얻은 용액 3 mL를 카트리지 상단에 가하여 1∼2 방울/초의 속도로 유출시켜 버린다. 이어서 물 3mL로 씻어 버린 후, 고정상 상단이 노출되기 전에 아세토니트릴 : 물(50 : 50) 혼합액 3 mL를 가하고 용출하여 받는다. 고정상 상단이 노출되기 전 아세토니트릴 : 물(50 : 50) 혼합액 3 mL를 추가로 가하여 앞서 받은 액과 합한다. 용출액은 3 mL까지 질소 농축하여 멤브레인 필터(PTFE, 0.2 μm)로 여과한 후 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 기체크로마토그래프-질량분석기 분석조건

가) 컬럼 :DB-5MS(30 m × 0.25 mm, 0.25 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상가스 및 유속 : 헬륨, 1.2 mL/분

다) 오븐 온도 : 90℃에서 3분간 유지한 후 45℃/분의 속도로 180℃까지 승온하고 5℃/분의속도로 200℃까지 승온하고 다시 100℃/분의 속도로 300℃까지 승온하고 5분간 유지

라) 주입부 온도 : 280℃

마) Interface 온도 : 280℃

바) 이온화 : 전자충격(EI), 70 eV

사) 주입모드 : splitless

아) 주입량 : 1 μL

자) 기체크로마토그래프-질량분석기 분석을 위한 특성이온

분석성분 (Compound)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion,m/z)	생성이온(Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
니트라피린 (Nitrapyrin)	230.9	228.9	194	1331)	16
				158	18
			196	135	16
1)정량이온

2)액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼 : C18계 역상 컬럼 또는 이와 동등한 것

나) 컬럼 온도 : 40℃

다) 이동상

(1) 이동상 A : 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴

(2) 이동상 B : 0.1% 포름산 함유 물

(3) 농도구배조건

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	5	95
2.0	5	95
7.0	90	10
8.0	90	10
8.5	5	95
10.0	5	95

라) 이동상 유속 : 0.3 mL/분

마) 주입량 : 2 μL

3) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법 : ESI positive-ion mode

나) Capillary voltage : 1.0 kV

다) Collision gas :아르곤(Ar)

라) 액체크로마토그래프-질량분석기 분석을 위한 특성이온

분석성분 (Compound)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온(Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
대사산물 (6-CPA)	157.6	156.9	158	1121)	25
				140	15

4) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

5) 표준품의 크로마토그램

그림 1. 기체크로마토그래프-질량분석기에서 표준품의 크로마토그램 예시.

니트라피린(6.6분)

* 분석기기 : GC(Thermo Fisher Trace 1310), MS/MS(Thermo Fisher TSQ 9000),

컬럼(Agilent Technologies, DB-5MS, 30 m × 0.25 mm, 0.25 μm)

그림 2. 액체크로마토그래프-질량분석기에서 표준품의 크로마토그램 예시.

6-chloropyridine-2-carboxylic acid(4.3분)

* 분석기기 : LC(WatersⓇAcquity UPLC), MS/MS(WatersⓇXevo TQ-S),

컬럼(Cadenza CD-C18HT, 2.0 mm × 100 mm, 3.0 μm)

6) 정량한계
0.01 mg/kg

사. 정성시험위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름시간(retention time)과 비교하여 일치하여야 한다.

아. 정량시험정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피크 높이 또는 면적에 따라정량한다.

※ 니트라피린의 잔류량 = 니트라피린의 잔류량 + (환산계수* × 6-CPA의 잔류량)

* 환산계수 = 1.47(니트라피린 분자량 231 / 6-CPA 분자량 157)

자. 확인시험기체크로마토그래피-질량분석기 및 액체크로마토그래프-질량분석기상의 머무름 시간과특성이온으로 니트라피린 및 대사체를 확인한다.