1.7 곰팡이수(Howard Mold Counting Assay)

가. 시험법 적용범위

고춧가루, 천연향신료, 향신료조제품 등에 적용한다.

나. 장치

1) 균질기

변속 가능한 균질기로서 4～8개의 날카로운 스테인리스 교반날이 200 mL 용량의 스테인리스 컵 용기의 바닥 부근에서 회전하며 최소 0～10,000 rpm의 회전속도가 가능하고 회전속도계가 붙어 있는 균질기를 사용한다.

2) 하워드곰팡이계수슬라이드(Howard Mold Counting slide)

외호에 의해 둘러싸인 20 × 15 mm 크기의 사각의 한 조각으로 된 유리슬라이드이다. 검체점적평면의 양쪽 측면 커버글라스 받침대가 검체점적 평면보다 0.1 mm 더 높게 나란히 솟아올라 있다. 커버글라스가 받침대 위에 올려지면 검체점적평면과 커버글라스 사이의 깊이가 0.1 mm가 되는 것을 사용한다.

3) 현미경

4개의 무채색 대물렌즈가 장착 되어 있고 10～400배 배율로 관찰이 가능한 것을 사용한다.

다. 시약 및 시액

1) 1% NaOH용액

2) 실리카겔액 소포제 또는 2-옥탄올(2-octanol)

3) 안정액(5% 펙틴용액)：교반기에 85℃ 물 475 mL를 넣고 교반하면서 펙틴 25 g을 소량씩 첨가하면서 용해시킨다.

라. 시험용액의 조제

1) 검체 5 g을 평량하여 균질기에 넣는다. 1% NaOH용액 100 mL를 2회로 나누어 넣고, 1회 첨가 시는 약 30 mL를 넣고 10,000 rpm에서 5초간 혼합한 다음 나머지 약 70 mL로는 균질기 내벽의 부착물을 씻어 내린다. 다시 균질기 내의 혼합물을 10,000 rpm에서 3분간 교반한 후 실리카겔소포제 3∼4방울을 떨어뜨려 거품을 제거하고 위의 혼합물 100 g을 25 g의 안정액과 혼합하여 현미경 검경검체로 한다.

마. 시험조작

1) 현미경 검경검체의 조작

하워드곰팡이계수슬라이드의 검체평면에 스포이드를 이용하여 검체를 점적한다. 점적된 검체에서 큰 검체 조각이나 씨 등을 마이크로핀셋으로 집어낸 후 얼룩이 지거나 선이 생기지 않도록 조심스럽게 커버글라스를 얹는다. 그런 다음 현미경의 제물대 위에 하워드곰팡이계수슬라이드를 끼운다.

2) 곰팡이 균사의 진단

현미경의 100～450배에서 관찰할 때 곰팡이 균사는 다음의 외관특성을 지닌다.

가) 세포벽의 평행

곰팡이 균사는 튜브형태이고 대개의 경우 균사의 직경은 전체의 길이에서 일정하다. 이들 균사체의 세포벽은 현미경하에서 평행하게 보이며 이것이 다른 섬유질과 구별하여 곰팡이로 인식하는 가장 유용한 특징이다. 예외적인 경우로 몇몇 큰 곰팡이의 경우 세포벽이 붕괴되거나 꼬여 있을 수 있으며 어떤 곰팡이의 균사체는 측면을 따라 부풀어 있어 세포벽이 평행하지 않기도 하다. Mucor속이나 Giatrichum속은 흔히 차차 가늘어지기도 한다. Mucor속과 몇몇 곰팡이들은 격벽이 없다.

나) 분절

대부분의 곰팡이 균사는 격벽에 의해 분절되어 있다. 몇몇 식물의 섬모도 분절된 형태를 보이지만 이들의 세포벽은 흔히 날카롭게 정점을 이루면서 한점으로 수렴되는 뾰족한 형태를 하고 있는 점이 곰팡이의 분절과 다르다.

다) 입자형성

얇은 벽을 지닌 버너형의 균사체는 세포벽에서 관찰할 수 있는 원형질을 포함하고 있으며 고배율에서 입자상을 나타낸다. 이러한 형태는 대형의 Mucor속에서 가장 선명하게 볼 수 있다. 탄저를 일으키는 곰팡이와 같은 미세한 종류의 곰팡이는 원형질 입자가 선명하지 않다.

라) 분지

곰팡이 균사가 짧은 경우를 제외하고는 대부분이 다양한 분지를 보인다. 분지가 있는 상태라면 곰팡이로 인식할 수 있는 뚜렷한 특성의 하나이다.

마) 균사의 말단

천연의 균사체 끝은 마치 손가락의 끝처럼 항상 뭉툭하고 둥글다. 끝이 날카로운 균사체는 번식 중에 있는 균사를 제외하고는 드물다. 깨진 균사체의 끝은 정상적으로 사각형을 이룬다.

바) 비굴절성의 외관

균사는 빛을 강하게 반사시키지 않는 것이 특징이다. 곰팡이 검체조제 시에 곰팡이 균사와 닮은 구조를 하고 있으나 빛을 강하게 반사시키는 것은 곰팡이가 아닌 경우이다. 펴진 나선형태의 두꺼워진 식물도관의 벽과 같은 것이 그 예이다. 이들은 고체유리나 플라스틱 막대가 빛을 반사시키는 것처럼 빛을 강하게 반사시킨다.

3) 양성구획의 판정

1개의 가시구획에 대하여 양성 혹은 음성으로 판정한다. 어떤 구획도 한번 이상 양성으로 판정하여서는 아니 된다. 1개의 구획이 양성으로 판정되기 위해서는 3개 이하의 곰팡이 균사의 총길이(합친 길이)가 가시구획 직경의 1/6을 넘어야 한다. 대부분의 양성구획은 분지의 길이를 포함하여 1개의 균사의 길이를 근거로 판정되며 가시구획 직경의 1/6을 초과하여야 한다. 아래의 길이 중 하나가 가시구획 직경의 1/6을 넘으면 그 가시구획은 양성으로 판정한다.

가) 분지되지 않은 1개의 균사의 길이

나) 분지된 길이를 합산한 1개의 균사의 길이(총길이)

다) 2개의 균사의 길이를 합산한 길이

라) 3개의 균사의 길이를 합산한 길이

마) 곰팡이 덩어리로 이루어진 모든 균사의 총길이(곰팡이 덩어리는 1개의 조각으로 취급하며 모든 균사의 총길이)

4) 현미경 검경

조동나사와 미동나사를 적절히 조절하여 90～125배의 배율범위에서 가시구획의 물체들이 선명하게 보이도록 초점을 맞춘다. 검체평면에 아래 그림과 같이 25개의 원형의 가시구획을 설정하고 번호순서대로 곰팡이 균사체의 각 가시구획의 곰팡이 균사체 양성 또는 음성에 대해 판정한다.

1번 가시구획에서부터 25번 가시구획으로 옮겨 가면서 검경하여 각 가시구획별로 곰팡이 균사체의 양성 또는 음성에 대하여 판정한다. 1번에서 25번 구획까지 검경이 끝나면 하워드곰팡이계수슬라이드를 현미경에서 빼내어 세척하고 건조한다. 동일 시험용액을 사용하여 다시 한번 가)의 시험조작을 반복하고 25번 구획부터 1번 구획으로 옮겨 가면서 검경을 실시하여 총 50개 가시구획에 대하여 양성 또는 음성을 판정한다.

바. 계산관찰된 모든 구획(50개)을 검경한 결과 양성으로 판정된 구획의 비율%

(양성인 가시구획 / 검경한 총가시구획수) × 100 = 양성비율%