2.2.2.1 비타민A

가. 삼염화안티몬에 의한 비색정량법

1) 분석원리

비타민A(레티놀)가 SbCl3와 반응해서 청색을 나타내고, 그때의 청색은 비타민 A의 농도에 따라 변하는 것을 응용한 방법이다. 검체의 지질을 에탄올 중에서, KOH로 검화(알칼리 처리하여 지방은 지방산염으로 물에 녹여 제거하고)시킨 후 석유에테르로 Vit A를 추출한다.비타민 A는 클로로포름에 녹아 SbCl3와 반응하여 청색을 띄므로, 일정량의 검체용액을 취하고 SbCl3가 함유된 클로로포름을 가하여 발색시킨 후 620 nm의 분광광도계에서 흡광치를 측정한다.

2) 시약 및 시액

가) 에테르：필요하면 증류한다. 초류액 및 마지막 증유액 각 10%를 버린다.

나) 무알데히드에탄올：에탄올 1 L에 50% 수산화칼륨용액 5 mL 및 아연분말 5 g을 가해 약 2시간 환류냉각기을 달아 가온한 후 증류한다. 다만, 초류액 및 마지막 증류액 각 10%를 버린다.

다) 무수황산나트륨：무수황산나트륨을 2시간 이상 120℃에서 가열한 것을 실리카겔 데시케이터 중에 방냉한다(밀전해서 보존한다).

라) 초산：빙초산 1 L에 대해서 산화크롬 10 g을 가해 2회 증류한다. 116℃이상의 증류액을 취한다.

마) 클로로포름：클로로포름 1 L를 황산 20～30 mL씩으로 황산층이 착색되지 않을 때까지 수회 씻는다.

수세하여 황산을 제거하고，15～20% 수산화나트륨용액 20～30 mL로 2～3회 씻은 후 수세한다.

여기에 탄산칼륨을 가하여 혼합한 후 냉암소에 약 12시간 이상 방치하고 탈수시켜 증류한다. 정제한 클로로포름은 갈색유리병에 넣어 냉장에 보존한다. 보존 중 흡습하지 않도록 주의한다. 이 클로로포름은 적어도 1주간은 사용이 가능하다.

바) 정색용액：삼염화안티몬 20 g을 상기의 클로로포름 100 mL에 녹여 하룻밤 방치한 후 무수초산 2 mL를 가해 코르크마개나 폴리에틸렌마개를 하여 차광하여 상온으로 보존한다.

이 용액은 흡습성이 강하고 변질이 쉬우므로 조제 후 1주간 내에 사용한다.

사) 표준비타민A：비타민A유[1 g중 비타민A 10,000국제단위(IU) 함유]를 사용한다.

아) 불활성가스：질소, 이산화탄소를 사용한다.

3) 시험용액의 조제

가) 비누화：검체 채취량은 일반적으로 100～150단 위에 상당하는 양을 갈색 둥근바닥플라스크에 취하고 피로갈롤 100 mg, 하이드로퀴논 100 mg을 가한다. 다음에 적어도 3 mL 또는 동량의 50% 수산화칼륨용액 및 그 8배량의 무알데히드에탄올을 가해 환류냉각기를 부착하고 95℃ 수욕에서 2/3 잠기게 하여 때때로 플라스크를 흔들어 주면서 30분간 비누화한다.

나) 추출：비누화 후 흐르는 물에 식혀 냉각시키고 실온으로 한 다음 정확히 석유에테르 100 mL를 가한다 유리마개를 하고 15초간 격렬하게 흔든다. 침전이 있으면 그것이 침전될 때까지 방치한다. 다음에 250～300 mL의 갈색 분액깔때기에 옮기고 둥근바닥플라스크에 침전물을 남기고 침전물을 씻어 옮길 필요는 없다. 분액깔때기에 1N 수산화칼륨액 100 mL를 가하여 15초간 격렬히 흔든 후 방치하여 분리시킨다. 혼탁된 물층은 버리고 석유에테르층에 0.5N 수산화칼륨액 40 mL를 가해 진탕 혼합하고 다음에 석유에테르층을 적어도 4회 물 40 mL씩 매회 15초간 격렬하게 진탕 혼합하여 수세를 반복한다.(수세액에 페놀프탈레인시액으로 알칼리의 반응을 나타내지 않을 때까지 행한다)

다) 탈수：분액깔때기를 수분간 방치해서 최후의 물 1방울까지 제거한다. 이 석유에테르층에 산화방지제로서 소량의 디부틸히드록시톨루엔을 가한다.

라) 용제날림：상기의 석유에테르중 50 mL를 100 mL갈색 둥근바닥플라스크에 정확히 취해 약 45℃의 수욕상에서 수류펌프의 감압하에 재빠르게 증발시킨다. 불활성가스로 플라스크 내부를 치환한다.

마) 시험용액의 조제：잔류물에 직접 클로로포름을 피펫으로 가해서 1 mL중에 비타민A가 10～20단위가 되도록 희석하여 일정용량으로 한다.

4) 시험방법

가) 기기 측정 조건

시험용액 0.3 mL와 클로로포름 0.3 mL를 정확히 셀에 취하여 정색용액 3 mL를 가한다. 대조셀에 클로로포름 0.6 mL를 정확히 취한 다음 정색용액 3 mL를 첨가한 후 약 5～20초 사이에 파장 620 nm에서 흡광도를 측정한다.

나) 검량선의 작성

표준비타민A를 위의 방법에 따라 처리한다. 클로로포름에 녹여서 1 mL중의 비타민의 2, 4, 6 및 10 μg을 함유하는 용액을 조제한다. 계속해서 조제한 표준용액마다 시험용액의 비타민A의 측정에 따라 조작한다.

표준용액으로부터 구한 흡광도로 검량선을 작성하고 함량을 구한다.

5) 정량시험 계산

시험용액의 흡광도와 검량선으로부터 구한 시험용액 1 mL중의 비타민A의 양을 N μg이라고 하면,

시료중의 비타민A(μg/100 g) ＝ N × V ×	100	×2
	검체채취량(g)

V：시험용액 전량(mL)

나. 고속액체크로마토그래프에 의한 정량법

1) 장치

액체크로마토그래프 : 형광검출기를 사용한다.

2) 시약 및 시액

가) 무알데히드에탄올：에탄올(특급) 1 L에 50% 수산화칼륨용액 5 mL 및 아연분말 5 g을 가해 약 2시간 환류 후 증류한다. 다만, 초류액 및 마지막 증류액 각 10%는 버린다.

나) 무수황산나트륨：무수황산나트륨(특급)을 2시간 이상 120℃에서 가열한 후 데시케이터 중에서 방냉한 후 보관한다.

다) 표준용액의 조제

비타민A아세테이트 결정을 비누화시켜 비타민A 알코올로 하여 국제단위(I.U) 또는 μg단위로 환산한다. 이를 이소프로판올(특급)로 희석하여 각각 1.0 mL중 5, 25, 50 I.U가 함유되도록 한다. 사용 시 제조한다.

3) 시험용액의 조제

일반적으로 비타민A 20～30 IU(6～9 μg)에 상당하는 시료를 정밀히 달아 갈색 둥근바닥플라스크에 넣는다.

에탄올 30 mL 및 10% 피로갈롤에탄올용액 1 mL를 가하여 잘 섞은 후 수산화칼륨용액(9→10) 3 mL를 가해 환류냉각기를 부착하고 95℃ 수욕에 플라스크를 2/3 잠기게 하여 30분간 비누화시킨다. 신속히 냉각하여 실온으로 한 후 물 30 mL를 가해 갈색분액깔때기에 옮긴다. 플라스크는 물 10 mL로 씻고 이어서 석유에테르(특급) 30 mL로 씻은 후, 씻은 액은 분액깔때기에 합하여 잘 흔들어 혼합하여 방치한 후 물층을 별도의 갈색분액깔때기에 옮긴다. 물층은 석유에테르 30 mL씩으로 2회 추출하고, 전 석유에테르추출액을 합하여 물 10 mL 1회, 이어 50 mL 씩으로(페놀프탈레인시액으로 정색이 되지 않을 때까지) 씻는다. 분액깔때기 중에서 물을 충분히 분리한 석유에테르층을 무수황산나트륨에 통과시켜 탈수한 후 석유에테르층을 갈색플라스크에 옮긴다. 이어 황산나트륨을 석유에테르 10 mL씩으로 2회 씻고, 씻은 액을 앞의 플라스크에 가한다. 석유에테르추출액을 모두 합하여 40～50℃에서 감압증발건조한 후 잔류물을 이소프로판올(특급)으로 녹여 1.0 mL로 한 것을 시험용액으로 한다.

4) 시험방법

가) 고속액체크로마토그래프 조건

- 칼럼：역상 분배형

- 이동상：에탄올：물(95：5)

- 유속：0.5 mL/분

- 검출기：형광검출기(여기파장 340 nm, 측정파장 460 nm)

5) 정량시험

시험용액 및 표준용액을 각각 20 μL씩 주입하여 얻은 표준용액의 피크 면적 또는 높이에 의해 구한 검량선을 사용하여 시험용액의 비타민A의 농도(I.U/mL)를 구하고, 다음 식에 의해 검체중 비타민A의 함량(I.U/100 g)을 산출한다.

비타민A(I.U/100 g) ＝ S ×	a×b	×100
	검체채취량(g)

S：시험용액중의 비타민A의 농도(I.U/mL)

a：시험용액의 전량(mL)

b：시험용액의 희석배수