2.2.2.2 비타민B1

가. 브롬시안에 의한 티오크롬 형광법

1) 분석원리

식품 중의 비타민B1을 산성 수용액으로 완전히 침출하고, 그 침출액 중에 함유되어 있는 티오크롬반응 저해물질이나 티오크롬 형광 발색반응을 방해하는 형광물질을 퍼무티트에 이온교환시켜 침출액 붕의 불순물을 제거한 후, 알칼리성 페리시안 또는 알칼리성 브롬시안을 가하여 식품 중의 비타민B1염산염을 티오크롬으로 산화시킨 다음 이소부탄올에 이행시켜 이 티오크롬의 형광을 형광검출기로 측정하는 방법이다.

2) 장치 및 기구

가) 칼럼관

경질 유리제 흡착관의 S부의 밑에 소량의 유리솜을 채워 넣어 물을 가득 넣고 별도로 퍼무티트 1.3～1.5 g을 비커에 취한다.

물 약 20 mL를 가해 약하게 진탕해서 퍼무티트에 부착하고 있는 기포를 제거한 다음 물과 함께 전부를 흡착관에 유입, 계속해서 3% 초산 10 mL 및 물 20 mL를 각각 1분간에 1 mL의 유속으로 통해서 조정을 해 놓는다.

나) 추출병：50～150 mL까지 10 mL마다 표선을 그려놓은 것이 쓰기에 편리하다.

다) 형광분광광도계：분광식의 여기파장을 375 nm, 수광부의 형광선택파장을 420 nm에 조정해 쓴다.

3) 시약 및 시액

가) 효소용액：사용시 다가디아스타제 0.5 g에 0.1 N 염산 0.5 mL 및 물 10 mL를 가하여 용해한 후 여기에다 산성백토 0.2 g을 첨가하여 30초간 진탕 혼합하여 이것을 여과 또는 원심분리해서 그 상층액을 사용한다.

나) 25% 염화칼륨 염산용액：0.1 N 염산에 염화칼륨을 25%의 비율로 녹인다. 결정이 석출하면 가온하여 완전히 녹여 사용한다.

다) 퍼무티트：50～80메쉬(mesh)의 퍼무티트를 플라스크에 취해 약 4배의 열탕을 가해서 혼합, 정치한다. 상등액을 경사하여 버린다. 이 조작을 수회 반복하여 상등액이 거의 깨끗해질 때까지 행한다. 다음에 3%의 초산 약 4배량으로 전과 동일하게 2회 씻는다. 다시 25% 염화칼륨 염산용액을 약 3배량 가해서 비등수욕 중 약 25분간 저어주면서 처리한다. 또 다시 3% 초산으로 2회 씻어내고 수세의 조작을 반복한다. 이 세액에 5% 질산은용액 2～3방울을 가해서 백탁되지 않을 때까지 행한다. 이것을 약 60℃에서 건조해서 보존한다. 다만, 퍼무티트 외에 엠버라이트(Amberlite) IRC 50을 사용할 수 있다.

라) 산화제

(제1법) 페리시안․수산화나트륨용액：1% 페리시안용액 4 mL를 15% 수산화나트륨으로 녹여 100 mL로 한다. 사용전 4시간 이내에 제조한다.

(제2법) 브롬시안용액：특급의 브롬시안 4% 용액, 본액은 냉장고에 보존하여 그날 사용한다.

마) 무수황산나트륨：형광이 없는 것

바) 이소부탄올：무형광의 시판품을 사용하든가 형광이 인정되면 재증류 정제해서 사용한다.

사) 비타민B1표준용액：표준품을 사용한다. 염산산성의 물(pH4.5 HCl액)로 희석해서 1 μg/mL로 한다.

4) 시험용액의 조제

가) 추출

검체 1～10 g을 추출병 또는 100 mL의 메스플라스크에 취해 물 약 20 mL를 가하여 혼합해 0.1 N 염산 또는 0.1 N 황산 약 50 mL를 가하여 잘 섞은 후 끓는 수욕상에서 30분간 가열 추출한다.

나) 효소분해

추출액은 약 50℃에 냉각시켜 놓고 4 M 초산나트륨액을 적가해서, pH를 약 4.5에 조정한다. 다시한번 효소용액 약 2 mL를 가해서 40～50℃에 2～3시간 보온하든가 또는 톨루엔 5～6방울을 가해 37～40℃의 항온기에 넣어서 하룻밤을 방치한다. 다음에 15분간 비등수욕중에서 온침한다. 냉각 후 물을 가해서 100 mL로 하고 원심분리하든가 또는 여과해서 상등액을 취한다. 이것을 검체용액으로 한다.

다) 흡착

검체용액(pH 4.5)의 일정량(비타민B1으로서 약 5 μg을 함유하는 액량)을 칼럼에 조용히 주입한다. 1분간 1 mL의 유속으로 흡착케 한다. 계속해서 pH 4.5의 염산 5 mL로 칼럼의 R부의 내면을 씻어버린다.

라) 수세

흡착이 끝났다고 생각되면 공존하는 형광물질을 제거한다. 칼럼에 끓는 물을 주입하고 1분간 3～4 mL(1초간에 약 1방울)의 유속으로 흡착층을 씻는다. 세액을 형광이 나타나지 않을 때까지 물로 계속 씻어준다.

마) 탈착

수세가 끝나고 칼럼 하부의 플라스크를 25 mL의 메스플라스크에 교환 칼럼이 따뜻할 동안에 비등 25% 염화칼륨염산용액 10 mL를 가한다. 1초간 1방울씩 나누어 액이 적하되도록 조절한다. 탈착액을 받아서 용출액이 퍼무티트의 상단까지 달하면 재차 비등용출액 8 mL를 주입해 동일하게 조작한다. 최후에 동액 7 mL를 주입해서 탈착액의 전량을 약 25 mL로 하여 뚜껑을 닫아 놓는다. 뒤이어 메스플라스크를 실온에 방치한다. 냉각후 물을 가해서 정확히 25 mL로 하여 시험용액으로 한다.

5) 시험방법

(제1법：페리시안에 의한 산화 및 티오크롬의 추출)

시험용액을 5 mL씩 T1, T2및 T₃3개의 50 mL 공전시험관에 나누어 취한다. T1을 첨가시험용, T2를 주시험용, T3를 공시험용으로 한다. T1에는 비타민B1표준액 1 mL (비타민B11 μg)를, T2및 T3에는 물 1 mL를 가한다. 계속해서 T1및 T2에는 페리시안․수산화나트륨용액 3 mL를 가한 후 혼합한다. 이소부탄올 15 mL를 가해 마개를 꼭 막아 1분간 격렬히 진탕 혼합한다. T3에는 30% 수산화나트륨용액 3 mL를 가한 후 혼합한다. T1, T2와 같이 이소부탄올을 가해 진탕 혼합한다. T1, T2, T3의 시험관을 정치하든가 또는 1,000～1,500 rpm으로 2분간 원심분리해서 상등액의 이소부탄올을 피펫으로 별도의 시험관에 분취한다. 계속해서 무수황산나트륨 1～2 g을 소량씩 첨가해서 진탕 혼합한 후 정치해서 깨끗한 이소부탄올을 얻는다.

(제2법：브롬시안화에 의한 산화 및 티오크롬의 추출)

시험용액을 5 mL씩 T1, T2및 T33개의 50 mL공전시험관에 나누어 취한다. T1을 첨가시험용, T2를 주시험용, T3를 공시험용으로 한다. T1에는 비타민B1표준액 1 mL(비타민B1, 1 μg)을, T2및 T3에는 물 1 mL를 가한다. 계속해서 T1및 T2에는 브롬시안용액 3 mL를 가해서 혼합한 후 30% 수산화나트륨용액 3 mL를 혼합한다.

이소부탄올 15 mL를 가해 마개를 꼭 막아 1분간 격렬히 진탕 혼합한다. T3에는 30% 수산화나트륨용액 3 mL를 맨 처음 가한 후 브롬시안용액을 혼합한다. T1, T2와 동일 이소부탄올을 가해 진탕 혼합한다. T1, T2, T3의 시험관을 정치하든가 또는 1,000～1,500 rpm으로 2분간 원심분리해서 상등액의 이소부탄올을 피펫으로 별도의 시험관에 분취한다. 계속해서 무수황산나트륨 1～2 g을 소량씩 첨가해서 진탕 혼합한 후 정치해서 깨끗한 이소부탄올을 얻는다.

6) 정량시험

전항의 이소부탄올액을 형광셀에 넣어 형광도를 측정한다.

검체중의 비타민B1(mg/100 g)

＝D×

D：첨가 비타민B1(μg)

V1：검체용액의 채취량(mL)

V2：검체용액 전량(mL)

나. 고속액체크로마토그래프에 의한 정량법

1) 장치

액체크로마토그래프-형광검출기(Fluorescence Detector, FLD)를 사용한다.

2) 시약 및 시액

가) 4 M 초산나트륨용액 : 16.4 g의 초산나트륨을 물에 녹여 50 mL로 한다.

나) 다카디아스타제(Takadiastase) 용액 : 다카디아스타제를 물에 녹여 2%로 하고 원심분리한 후 상층액을 사용한다. 사용 시 조제한다.

다) 10% 삼염화초산 용액

라) 0.1 M 제일인산나트륨 용액

마) 0.01% 페리시안화칼륨·15%(w/v) 수산화나트륨 용액 : 수산화나트륨 150 g을 물에 녹여 1 L로 하고 이에 페리시안화칼륨(Potassium ferricyanide, K3[Fe(CN)6]) 100 mg을 녹인다. 사용 시 조제한다.

바) 표준용액의 조제 : 비타민B1염산염을 비타민B1으로 100 μg/mL가 되도록 10% 삼염화초산용액에 녹여 표준원액을 만든다. 표준원액을 0.1∼1.0 μg/mL가 되도록 희석한다. 희석한 비타민B1용액, 4 M 초산나트륨, 2% 다카디아스타제 용액을 20 : 3 : 1의 비율로 혼합한 용액을 표준용액으로 한다.

3) 시험용액의 조제

가) 일반적 검체

검체 1 g(액상의 경우 5 g)을 정밀히 달아 10% 삼염화초산용액 5 mL를 넣고 균질기로 2분간 균질화시킨다. 균질화한 용액을 10% 삼염화초산용액으로 10 mL로 한 후 고속원심분리관에 넣고 2000 ⨯g 이상에서 30분간 원심분리한다. 이 상층액에 4 M 초산나트륨, 2% 다카디아스타제 용액을 각각 20 : 3 : 1의 비율로 혼합하고 1시간 초음파 추출한 후 상등액을 취하여 0.45 μm의 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 사용한다.

나) 난용성 비타민B1염류 및 비타민B1유도체 강화검체

2.2.2.2 비타민B1가. 브롬시안에 의한 티오크롬 형광법 4) 시험용액의 조제에 따라 전처리된 시험용액을 사용한다.

4) 시험방법

가) 고속액체크로마토그래프의 측정 조건

(1) 칼럼 : 옥타데실실릴화한 칼럼(안지름 4.6 mm, 길이 250 mm, 충전제 Octadecylsilica) 또는 이와 동등한 것

(2) 이동상 : 0.1 M 제일인산나트륨용액

(3) 유속 : 0.7 mL/min

(4) 반응액 : 0.01% 페리시안화칼륨·15%(w/v) 수산화나트륨용액(유속 : 0.7 mL/min)

(5) 검출기 : 형광검출기(여기파장 : 375 nm, 측정파장 : 450 nm)

5) 정성시험

위의 조건에서 얻어진 크로마토그램상의 피크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하여야 한다.

6) 정량시험

표준용액과 시험용액을 각각 20 μL씩 고속액체크로마토그래프에 주입하고, 칼럼에서 분리 용출시킨 비타민B1을 반응액 송액펌프에서 보내진 반응액과 자동적으로 혼합시켜 형광물질(티오크롬)로 변환한다. 이 형광물질을 형광검출기로 보내 얻어진 표준용액 피크 면적 또는 높이에 의해 구한 검량선을 이용하여 시험용액의 비타민B1농도(μg/mL)를 구하고, 다음 식에 의해 검체 중 비타민B1의 함량(mg/100 g)을 계산한다.

가) 계산방법

비타민B1의 양(mg/100 g) = S × (a×b)/검체채취량(g) × 100/1,000

S : 시험용액 중의 비타민B1의 농도(μg/mL)

a : 시험용액의 전량(mL)

b : 시험용액의 희석배수