2.2.2.3 비타민B2

가. 루미플라빈 형광법

1) 분석원리

리보플라빈을 알칼리조건에서 광분해하여 루미플라빈으로 전환시킨 다음 이를 산성 조건에서 클로로포름에 이행시켜 황색의 형광광도를 측정하는 방법이다.

2) 장치

가) 광분해장치：형광등에 반사경을 달아 시험용액을 양측으로부터 조사하든지 또는 상부에 형광등이 붙어 있는 측면에는 광을 난반사하도록 한 상자모양의 것도 좋다.

나) 용기：갈색 유리기구를 쓴다.

다) 형광분광광도계：여기파장 430 nm, 측정파장 530 nm

3) 시약 및 시액

가) 클로로포름：형광이 없는 것 형광이 있는 것은 유리제의 증류장치를 써서 재증류한다. 갈색유리병에 넣어 물을 포화시켜 냉암소에 보존한다.

나) 비타민B2표준용액：비타민B2표준품을 온탕에 녹여서 40 μg/mL로 한다. 그 100 mL에 초산 수 방울을 가해서 갈색 공전병에 넣어 냉장고에 보존한다. 사용 시 희석해서 2 μg/mL의 액을 만든다. 밝은 곳에 내놓지 않도록 주의한다.

4) 시험용액의 조제

검체의 일정량을 취해 소량의 물을 가해서 균질기 또는 막자사발에 넣어 마쇄한다. 지방이 많은 것은 미리 탈지한다. 이것에 물 수 mL～수십 mL를 가해 수욕 중에서 혼합 15～20분간 추출한다. 대부분의 것은 이 추출법으로 충분히 추출된다. 또는 비타민B14) 시험용액의 조제 나) 효소분해까지의 시험용액을 그대로 사용할 수 있다. 추출액은 냉각 후 1 mL중 0.05 μg이 되도록 일정 용량으로 하여 시험용액으로 한다.

5) 시험방법

가) 광분해

시험용액 일정량(0.2～1 μg비타민B2를 함유하는 용액)씩을 3개의 공전시험관에 취한다. 그 한 개를 첨가시험용으로 해서 비타민B2의 일정량(0.2～1 μg)을 함유하는 용액을 가한다. 다른 두개 T2및 T3는 T1에 가한 비타민B2용액과 동량의 물을 가해서 T1, T2, T3를 같은 용량으로 한다. 이 검체용액에 1 N 수산화나트륨액을 동량 가해 혼합한 후 T1(첨가시험) 및 T2(주시험)를 광분해 장치로써 1시간 광분해 한다. T3(공시험)는 1시간 암소에 둔다. 광분해가 끝나면 각 시험관에 초산을 0.5 mL씩 가한다.

나) 산화 및 추출

광분해를 끝낸 산성용액에 4% 과망간산칼륨용액 0.5 mL를 가해서 1분간 방치한다(필요하면 초산을 소량 가한다). 계속해서 3% 과산화수소용액을 적가해서 탈색하고 클로로포름 10 mL씩을 가해서 뚜껑을 닫고 격렬히 2분간 진탕 혼합한다. 필요하면 원심분리를 행하고, 클로로포름층을 분취한다.

6)측정 및 계산

클로로포름층을 측정셀에 옮기고 T1(첨가시험), T2(주시험), T3(공시험)의 형광광도를 읽어 T1, T2, T3로 한다. 검체중의 비타민B2의 함량을 다음 식에 따라 구한다.

비타민B2(mg/100 g) ＝	D ×	T2-T3	×	V2	×	100	×	1
		T1-T2		V1		검체의 채취량(g)		1,000

D ：첨가 비타민B2(μg)

V1：시험용액 채취량(mL)

V2：시험용액 전량(mL)

나. 액체크로마토그래프에 의한 정량법

1) 장치

액체크로마토그래프 : 형광검출기를 사용한다.

2) 시약 및 시액

가) 메탄올：액체크로마토그래프용

나) 10 mM NaH2PO4용액：1 N 수산화나트륨용액으로 pH 5.5로 조정한다.

다) 표준용액의 조제

(1) 리보플라빈 표준용액：2.2.2.3 비타민B
2가. 루미플라빈 형광법과 동일하게 조제하고 사용 시 물로 희석하여 0.2 ㎍/mL의 용액으로 만든다.

(2) FMN(Flavin mononucleotide) 표준용액：FMN을 물에 녹여 0.2 ㎍/mL(리보플라빈으로 환산: × 0.7868* 또는 × 0.7317 **)의 용액으로 만든다.

* 376.36(리보플라빈 분자량)/478.33(FMN 무수물 분자량)

** 376.36(리보플라빈 분자량)/514.36(FMN 이수화물 분자량)

(3) FAD(Flavin adeninedinucleotide) 표준용액：FAD를 물에 0.5 ㎍/mL(리보플라빈으로 환산: × 0.4537*)의 용액으로 만든다.

* 376.36(리보플라빈 분자량)/829.51(FAD 무수물 분자량)

3) 시험용액의 조제

검체 일정량을 달아 소량의 물을 가해 균질기 또는 막자사발에서 가능한 한 미세하게 분쇄하고 지방이 많은 경우에는 미리 탈지한다. 이에 물을 가해 수욕중(70～80℃)에서 잘 혼합하여 12～20분간 추출한다. 추출액은 식힌 후 1 mL 중 비타민B20.05～0.5 μg이 되도록 일정용량으로 하여 시험용액으로 한다.

4) 시험방법

가) 액체크로마토그래프 조건

(1) 칼럼：역상 분배형(μ-Bondapak C
18, Micropak-CH, Cosmosil 5 C 18, Develesil ODS 등)

(2) 이동상：메탄올：10 mM NaH
2PO4용액(pH 5.5) (35：65)

(3) 유속：0.8 mL/분

(4) 검출기：형광검출기(여기파장：445 nm, 측정파장：530 nm)

5) 측정 및 계산

시험용액 및 각 형의 표준용액을 각 10 μL씩 주입하여 앞의 조건에서 시험한다. 표준용액 각 형의 피크 면적 또는 높이에 의해 구한 검량선을 사용하여 시험용액의 비타민B2의 농도(μg/mL)를 구하고, 다음 식에 의해 검체중 비타민B2함량(mg/100 g)을 산출한다.

비타민B2(리보플라빈, FMN, FAD)(mg/100 g)＝S ×	a×b	×	100
	검체채취량(g)		1,000

S：시험용액중의 비타민B2의 농도(μg/mL)

a：시험용액의 전량(mL)

b：시험용액의 희석배수