2.2.2.4 비타민C

가. 2.4-디니트로페닐하이드라진(Dinitrophenyl hydrazine, DNPH)에 의한 정량법

1) 분석원리

식품 중의 비타민C를 메타인산용액으로 추출한 환원형 비타민C(AA)를 2,6-dichlorophenol-indophenol(DCP)로 산화시켜 산화형(DHAA)으로 만든 다음 2,4-DNPH(dinitrophenyl hydrazine)를 가해 적색의 오사존(osazone)을 형성시킨 후 황산(H2SO4)을 가해 탈수시키면 등적색의 무수물bis-2,4-dintrophenylhydrazine으로 전환되어 안정된 정색반응을 나타내는데, 이를 파장 520 nm에서 표준용액과의 흡광도를 측정하여 정량하는 방법이다.

2) 시약 및 시액

가) 메타인산-초산용액：메타인산 15 g을 초산 40 mL 및 물 200 mL로 잘 진탕 혼합하여녹여서 물을 가해 250 mL로 한다. 이 용액은 냉장고에 보관하면 1주간 사용할 수 있다.

나) 묽은메타인산-초산용액：메타인산-초산용액을 같은 양의 물로 혼합한다.(사용시 조제).

다) 20% 메타인산용액：냉장고에 보존한다.

라) 10% 메타인산용액：냉장고에 저장하여, 2주간 사용할 수 있다.

마) 5% 메타인산용액：사용할 때 조제한다.

바) 인도페놀용액：2,6-디클로로페놀 인도페놀나트륨염 0.2 g을 더운물에 녹여 100 mL로 한다. 필요하면 여과한다. 본 용액은 냉장고에 보존하고 2주간 사용할 수 있다.

사) 메타인산-티오요소용액：10% 메타인산용액 50 mL에 티오요소 2 g을 녹인다. 물을 가해 100 mL로 한다(사용시 조제).

아) 디니트로페닐하이드라진용액：2, 4-디니트로페닐하이드라진 2 g을 9 N 황산액 100 mL에녹인다. 유리여과기로 여과한다. 본 용액은 냉장고에 보존하면 2주간 사용할 수 있다.

자) 비타민C 표준용액

비타민C 표준품 100 mg을 정밀히 단다. 메스플라스크에 넣어 5% 메타인산용액에 녹여서 100 mL로 한다.

그 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 및 2.5 mL를 각각 메스플라스크에 취해 5% 메타인산용액을 가해서 100 mL로 한다(사용시 조제).

3) 시험용액의 조제

조작은 모두 신속히 행한다.

가) 추출

검체의 일정량을 정밀히 단다. 정확히 같은 양의 메타인산-초산용액을 잘 혼합해서 균등한 죽 상태로 한다. 환원형 비타민C로서 1～5 mg 함유되도록 균등한 죽상태의 일정량(W g)을 100 mL의 메스플라스크에 옮기고 묽은 메타인산-초산용액으로 100 mL로 한다. 이 용액을 여과하여 처음의 수 mL를 제거해서 그 후의 여액을 취하던가 또는 원심분리해서 상등액을 취하여 시험용액으로 한다.

4) 시험방법

가) 기기 측정조건

(1) 산화 : 시험용액 2 mL를 시험관 T1, T2및 T3에 취해 T 1에 인도페놀용액 1방울을 혼 합해서 이것이 적색을 나타내는지 확인하고, T 1, T2및 T3에 메타인산-티오요소 용액 2 mL씩을 가한다.

(2) 오사존의 생성：시험관 T1및 T2에 디니트로페닐하이드라진용액 1 mL씩을 가해 3 7℃(±0.5℃) 항온수욕중에서 정확히 3시간 방치하고 T 3와 함께 얼음물 중에 침지한다.

(3) 오사존의 용해 : 얼음물 중에서 냉각하면서 T1, T2및 T3에 85% 황산용액 5 mL를 조금씩 적가해서 1분간 얼음물 중에서 내용액을 잘 혼합 냉각한다. 다음에 차가운 상태에서 T 3에 디니트로페닐하이드라진용액 1 mL를 혼합한다. T 1, T2및 T3의 내용액을 재차 혼합한 후 얼음물로부터 꺼내서 실온에서 30～40분간 방치한다.

(4) 비색：T1및 T2의 내용액에 대해서 510～540 nm에서 흡광도를 측정하고, T 1및 T2로 한다. 대조액은 T 3로 한다.

나) 검량선의 작성：비타민C 표준용액의 각 2 mL씩을 시험관에 취하고 위의 시험방법 (1)～(4)에 따라서 조작한다. 각각 흡광도를 구하고 검량선을 그린다.

5) 계산

시험용액 2 mL중의 총 비타민C량 및 산화형 비타민C량을 각각의 환원형 비타민C량(μg)으로 나타낸 수치를 검량선에서 찾아서 T1및 T2에 대응하는 점으로부터 구하여 C1및 C2로 한다. 검체중의 비타민C 함량은 다음 식으로 구한다.

총 비타민C (mg/100 g)＝	C1	× 50 ×	검체채취량×2	×	100
	1,000		W		검체채취량(g)

산화형비타민C (mg/100 g)＝	C2	× 50 ×	검체채취량×2	×	100
	1,000		W		검체채취량(g)

환원형비타민C(mg/100 g)＝총 비타민C(mg/100 g)-산화형비타민C(mg/100 g)

나. 인도페놀적정법에 의한 정량

1) 분석원리

식품 중 비타민C가 산성 수용액 중에서 2,6-dichlorophenol-indophenol(DCP)를 환원시켜 탈색하는 것에 기초한 환원형 비타민C 정량법이다.

2) 시약 및 시액

가) 인도페놀용액：미리 탄산수소나트륨 약 50 mg을 더운물 약 150 mL에 용해하고 여기에 2,6-디클로로페놀 인도페놀나트륨염 약 50 mg을 용해시키고 냉각 후 물로 200 mL로 한다. 여과 후 차광하여 냉소에 저장하면 일주간 사용할 수 있다. 다만, 다음 방법에 따라 사용할 때 표정한다.

3) 시험방법

조작은 모두 신속히 행한다.

가) 표정

비타민C 표준품 100 mg을 정밀히 달아서 500 mL의 메스플라스크에 넣어 묽은 메타인산-초산용액으로 500 mL로 한다. 그 5 mL를 정밀히 취하여 묽은메타인산-초산용액 5 mL를 가하고 인도페놀용액으로 액이 적어도 5초간 적색이 지속될 때까지 적정한다. 여기에 적정된 인도페놀용액의 소비량을 T mL로 한다.

나) 환원형비타민C의 적정

2,4-디니트로페닐하이드라진법에서 조제한 시험용액 10 mL를 삼각플라스크에 정확히 취하여 즉시 인도페놀용액으로 액이 적어도 5초간 적색이 지속될 때까지 적정한다. 이때 적정된 인도페놀용액의 소비량을 S mL로 한다.

4) 계산

검체중의 환원형비타민C는 다음 식에 의해 구한다.

환원형비타민C(mg/100 g)＝A mg×	S	×10	검체채취량×2	×	100
	T		W		검체채취량(g)

A mg：인도페놀용액 T mL에 대응하는 아스코르빈산량

다. 고속액체크로마토그래프에 의한 정량법

1) 장치

액체크로마토그래프 : 자외부검출기를 사용한다.

2) 시약 및 시액

가) 10% 메타인산용액：메타인산 10 g을 물에 녹여 100 mL로 한다. 불용물이 생기는 경우여과하여 사용한다. 냉장고에서 일주일까지 보관할 수 있다.

나) 5% 메타인산용액：10% 메타인산용액을 물로 2배 희석한다. 사용 시 조제한다.

다) 표준용액의 조제

아스코르빈산 10.0 mg을 정밀히 달아, 5% 메타인산용액에 녹여 100 mL로 한 것을표준원액(100 ppm)으로 한다. 필요한 경우 표준원액에 5% 메타인산용액을 넣어 원하는농도로 희석하여 사용한다. 사용 시 조제한다.

3) 시험용액의 조제

검체 일정량(비타민C함량이 50 mg/100 g 이상인 경우 2 g 정도, 10 mg～50 mg/100 g인 경우 5～10 g 정도를 검체로 한다)을 정확히 달아, 동량의 10% 메탄인산용액을 가하여 10분간 현탁시킨 후 적당량의 5% 메탄인산을 넣어 균질화한다. 균질화된 검체를 100 mL 메스플라스크에 옮기고 소량의 5% 메탄인산용액으로 용기를 씻은 후 메스플라스크에 합하여 100 mL로 한다. 그 후 3,000 rpm에서 10～15분간 원심분리를 행하여 상등액을 취하고 5% 메탄인산용액으로 적당히 희석하여 시험용액으로 한다.

4) 시험방법

가) 고속액체크로마토그래프 조건

(1) 칼럼：역상칼럼분배형(Jascopack Fine Sil-NH2, Lichrosorb NH 2, 조건을 달리하며, Zipax SAX, Vydac SAX., Partisil-10SAX, μ-Bondapak C 18, μ- Bondapak/CN, Pormaphase CPS등을 사용할 수 있다)

(2) 이동상：0.05 M KH2PO4/아세토니트릴(60：40)

(3) 유속：1.0 mL/분

(4) 검출기： 자외부(UV) 검출기(254 nm)

5) 정량시험

시험용액 및 표준용액을 각각 10 μL씩 주입하여 얻은 피크의 넓이 또는 높이를 구하여 검량선을 작성한 후 시험용액의 비타민C의 농도(μg/mL)를 구하고, 다음 식에 의해 검체중 아스코르빈산의 함량(mg/100 g)을 산출한다. L-아스코르빈산 나트륨으로 환산하는 경우에는 L-아스코르빈산량에 계수 1.125를 곱한다.

비타민C 함량(mg/100 g)＝S×	a×b	×	100
	검체채취량(g)		1,000

S：시험용액중의 아스코르빈산의 농도(μg/mL)

a：시험용액의 전량(mL)

b：시험용액의 희석배수